肠系膜缺血/再灌注损伤是肠道手术中常见的并发症之一，是严重创伤、休克、心肺功能不全等救治过程中共有的病理过程。近年来，随着病理生理学研究的深入，发现氧化应激损伤、炎症反应以及继发的肠系膜细胞凋亡是肠系膜缺血/再灌注损伤发生发展的重要病理机制之一^[1-4]。黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的根，始载于《神农本草经》，具有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌之功效，为常用中药之一。现代药理学研究发现，黄芪预处理对脑组织和心肌组织缺血/再灌注损伤均具有显著的保护作用^[5-7]，但是否对肠系膜缺血/再灌注损伤具有保护作用仍未见文献报道。本实验采用黄芪预处理7 d后，通过夹闭肠系膜上动脉45 min后去夹恢复血流再灌注的方法制备的肠系膜缺血/再灌注大鼠模型，研究黄芪预处理对大鼠肠系膜缺血/再灌注损伤的保护作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法 1.1 实验药物与试剂

黄芪注射液（成都地奥九泓制药厂，20 g：10 mL，批号：20141209）；银杏叶提取物（神威药业集团有限公司，17.5 g：5 mL，批号：140725）；苏木精-伊红（HE）试剂盒、原位末端标记（TUNEL）试剂盒，C反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）试剂盒，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（Caspase-9）酶联免疫（ELISA）试剂盒购自北京博奥森生物工程有限公司；核因子-κB（NF-κB）单抗购自碧云天公司；抗氧化酶活性[超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）]试剂盒和丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 动物

清洁级雄性Wistar大鼠（8周龄，180~220 g），由河北省实验动物中心提供，许可证号：SCXK（冀）2008-1-003。

1.3 动物分组与模型制备

将120只实验用大鼠按照随机数字表法随机分为假手术组、模型组、银杏叶提取物（3.15 mg/kg）预处理组和黄芪（5、10和20 g/kg）预处理组。各预处理组于术前7 d开始腹腔注射给药，每日1次，其中假手术组和模型组分别给予等体积的生理盐水。参照朱枝祥等^[8]报道的实验方法制备肠系膜缺血/再灌注大鼠模型，造模结果的判定：夹闭肠系膜上动脉后肠管颜色变暗，松开动脉夹后颜色逐渐变红，即可判定造模成功。

1.4 肠组织观察及含水量的测定

麻醉后开腹观察回盲部肠管外观并取回盲部10 cm以上的相同部位4 cm的肠管，称量湿质量（W₁）；置于107 ℃烘烤72 h后称量干质量（W₂），计算肠组织含水量：含水量（%）=[（W₁－W₂）/W₁]×100%

1.5 肠组织病变的观察及Chiu’s评分

取大鼠肠管组织并置于4%多聚甲醛溶液固定后，经石蜡包埋、切片（厚度约5 μm）后，行常规HE染色，通过光学显微镜观察各组大鼠肠组织病理性形态学变化；然后参照Chiu等^[9]报道的方法进行肠组织损伤评分（Chiu’s 6级评分标准）：0分：结构正常；1分：肠黏膜绒毛顶端上皮下间隙增宽；2分：绒毛尖端上皮抬高与固有层剥离；3分：绒毛两侧上皮成块脱落；4分：上皮完全脱落，仅存固有层结构；5分：黏膜固有层崩解、出血和溃疡。

1.6 肠组织中SOD、CAT活性，MDA含量及CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量的测定

取肠组织、研磨匀浆，经3 000 r/min离心10 min后取上清液，按照试剂盒说明进行操作，通过紫外-可见分光光度计测定肠组织中SOD、CAT活性和MDA含量；按照ELISA试剂盒说明进行操作，通过酶标仪测定肠组织中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量水平。

1.7 细胞凋亡状况的观察及凋亡指数的测定

石蜡组织切片经脱蜡水化处理后，按照TUNEL试剂盒方法依步进行处理，通过光学显微镜进行观察（细胞核黄染为阳性着色）。凋亡指数（AI）的计算：每张染色切片随机选取6个视野，计数每个视野中总细胞数和阳性细胞数，然后计算AI值：AI（%）=（阳性细胞数/总细胞数）×100%

1.8 肠组织中Caspase-3和Caspase-9活性的测定

参照陈良金等^[10]报道的方法：取肠管组织，加入适量冷裂解液后行研磨匀浆，经3 000 r/min离心10 min后取上清液，各组均取等量蛋白加入5 μL Caspase-3作为底物，经37 ℃避光孵育4 h后，测定405 nm处A值，以“实验组A值/对照组A值”表示Caspase-3的活性；Caspase-9活性检测方法同Caspase-3活性检测方法。

1.9 肠组织中NF-κB蛋白表达的检测及半定量分析

取1.8制备的肠组织匀浆液，经12 000 r/min低温（4 ℃）离心20 min后取沉淀，采用BCA法行蛋白定量，变性后上样、电泳（待溴酚蓝接近胶底部时停止）、转膜、春红溶液染色，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗（NF-κB，β-actin）4 ℃过夜；洗膜，二抗室温摇床上孵育1 h后经增强化学发光法（ECL）显色，实验结果应用Quantity One软件进行分析。

1.10 统计学方法

运用统计学软件SPSS 18.0进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠肠组织表观及含水量

模型组大鼠肠组织明显黑暗、呈水肿状；较模型组，黄芪预处理组肠组织较为红润、水肿症状明显较轻，以黄芪20 g/kg组效果最为显著。计算含水量：模型组大鼠肠组织含水量较假手术组显著升高（P < 0.01）；较模型组，黄芪（10、20 g/kg）预处理组肠组织含水量显著降低（P < 0.05或P < 0.01），见表 1。

2.2 各组大鼠肠系膜病变及Chiu’s评分

模型组大鼠肠系膜较假手术组呈现明显的病理性形态学变化：黏膜上皮细胞脱落，绒毛尖端上皮抬高与固有层分离，中性粒细胞浸润等；而较模型组，黄芪预处理组大鼠肠组织病变明显较轻，以20 g/kg组效果最为显著，结果见图 1。Chiu’s评分：模型组大鼠肠组织Chiu’s评分较假手术组显著升高（P < 0.01）；而较模型组，黄芪（10、20 g/kg）预处理组大鼠Chiu’s评分显著降低（P < 0.05或P < 0.01），结果见表 1。

2.3 各组大鼠肠组织SOD、CAT活性和MDA含量

模型组大鼠肠组织中SOD、CAT活性较假手术组显著降低且MDA含量显著升高（P < 0.05或P < 0.01）；与模型组比较，黄芪（10、20 g/kg）预处理组大鼠SOD、CAT活性显著升高、MDA含量显著降低（P < 0.05或P < 0.01），结果见表 2。

2.4 各组大鼠肠组织中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量

模型组大鼠肠组织中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量较假手术组显著升高（P < 0.01），IL-10含量显著降低（P < 0.01）；而较模型组，黄芪（10、20 g/kg）预处理组大鼠肠组织中CRP、TNF-α、IL-6含量显著降低（P < 0.05或P < 0.01），20 g/kg预处理组IL-1β含量显著降低且IL-10含量显著升高（P < 0.05），结果见表 3。

2.5 各组大鼠肠系膜细胞凋亡状况及AI

模型组凋亡细胞数量较假手术组明显增多，而经黄芪预处理7 d能够明显降低肠系膜缺血/再灌注大鼠肠系膜细胞凋亡数量，结果见图 2。计算AI：假手术组AI为（2.2±0.4）%，模型组AI为（42.5±5.1）%，黄芪（5、10、20 g/kg）组AI分别为（37.4±5.3）%、（18.9±3.6）%、（12.5±2.4）%，银杏叶提取物组AI为（21.7±3.3）%；模型组AI较假手术组显著升高（P < 0.01）；较模型组，黄芪（10、20 g/kg）组AI显著降低（P < 0.01）。

2.6 各组大鼠肠组织中Caspase-3、Caspase-9的活性

模型组大鼠肠组织中Caspase-3、Caspase-9活性较假手术组均显著升高（P < 0.01），与模型组比较，黄芪（10、20 g/kg）预处理组Caspase-3、Caspase-9活性显著降低（P < 0.05或P < 0.01），结果见表 4。

2.7 各组大鼠肠组织NF-κB蛋白表达

模型组大鼠肠组织NF-κB蛋白表达较假手术组显著升高（P < 0.01）；与模型组比较，黄芪（10、20 g/kg）预处理组大鼠NF-κB蛋白表达显著降低（P < 0.05或P < 0.01），结果见图 3和表 4。

3 讨论

缺血/再灌注后，随着氧的大量涌入而导致氧自由基的大量产生和过剩，为氧化应激损伤的病理基础。正常生理状态下，体内生成的氧自由基能够在超氧化物歧化酶（SOD）作用下还原生成过氧化氢（H2O2），并在CAT催化作用下进一步被还原生成对人体无害的水（H2O）和氧气（O2）^[11-13]；脂质过氧化终产物MDA含量也能够间接反映系膜细胞氧化损伤程度。细胞炎性因子CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6也是临床上用来监测体内炎症反应的常用指标^[14-15]。

细胞凋亡是由多种蛋白参与调控的程序性死亡过程，其中Caspases蛋白家族参与细胞凋亡启动以及整个过程的调节，Caspase-3被认为是各种凋亡刺激因子激活的关键蛋白酶^[16]，而Caspase-9为Caspase-3的活化刺激因子^[17]。细胞凋亡具有多种诱发因素，氧化应激损伤便为其中非常重要的因素之一^[10]，NF-κB为多效能核转录因子，是连接氧化应激损伤和细胞凋亡的“桥梁”。Angkeow P等^[18]和Deshpande SS等^[19]研究发现，氧化应激或氧自由基可直接或间接激活NF-κB，活化的NF-κB将转位进入细胞核内，与凋亡相关基因如c-myc等NF-κB调控元件结合，促进基因转录并诱导细胞凋亡。

本实验通过夹闭肠系膜上动脉45 min后去夹的方法制备的肠系膜缺血/再灌注损伤大鼠模型并以银杏叶提取物作为阳性对照进行研究发现，黄芪预处理能够有效降低肠组织含水量，改善肠系膜组织病变、降低Chiu’s评分，抑制肠系膜细胞凋亡；能够改善肠组织SOD、CAT活性并降低MDA含量，降低肠组织CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量并提高IL-10含量，降低Caspase-3、Caspase-9活性，下调NF-κB蛋白表达，提示黄芪预处理对大鼠肠系膜缺血/再灌注损伤具有保护作用，作用机制可能与黄芪能够有效改善抗氧化酶活性、提高自由基清除能力、抑制炎症细胞因子表达、降低促凋亡蛋白表达有关。