流行病学调查显示，心血管疾病在全球范围内已成为现今威胁人类健康的主要原因之一^{[1, 2]}。在中国每年约300万人死于心脑血管疾病，占每年总死亡病因的51%^[3]。研究发现，心血管疾病的发生发展与活性氧簇（ROS）关系密切^{[4, 5]}。ROS在细胞内过量蓄积，是由于机体受到氧化性刺激导致细胞内氧自由基的消除与产生打破了原有平衡^[6]。近年来很多报道称，红景天在心血管保护方面有很强的作用，能有效减小心肌缺血再灌注损伤、减少心肌梗死面积、保护心肌细胞等作用^{[7, 8]}。大株红景天注射液的主要成分为红景天，其在临床上常用于治疗冠心病稳定型劳累性心绞痛。本研究拟采用缺氧/复氧损伤细胞模型，探讨大株红景天注射液对缺氧/复氧损伤的原代心肌细胞的保护作用及其可能机制，为其临床应用提供实验依据。

出生1~3 d健康SD大鼠，雌雄不限（中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所实验动物中心），大株红景天注射液（通化玉圣药业有限公司），胎牛血清（Hyclone公司），胰蛋白酶（Solarbio公司），Ⅱ型胶原酶（Sigma公司），DMEM/F-12基础培养基（Gibco公司），CMH2DCF-DA探针（Invitrogen公司），JC-1探针（上海碧云天生物技术有限公司），超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究院）。

缺氧培养室（Thermo Forma公司），二氧化碳（CO₂）培养箱（Thermo 3111），Ti-U倒置荧光显微镜（日本尼康），Osterode离心机（德国Thermo Fisher），多功能读板机（Thermo Flexstation3）。

无菌条件下取出生后 1~3 d SD 乳鼠心脏若干，采用0. 06% 胰酶和0.1%Ⅱ型胶原酶在37 ℃恒温摇床中震荡消化5~6次，并收集上清液，最后加入含10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基以终止。终止后的消化液用200目筛过滤去除未消化组织块，1 000 r/min离心10 min，弃上清，用全培基将细胞沉淀充分而轻柔地吹打成单细胞悬液，接种于培养瓶中，放入37 ℃ CO₂培养箱内静置培养，根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同，采用差速贴壁 90 min，接种至 75 mL培养瓶中，24 h 后更换培养液，同时小心洗去除未贴壁细胞，再经 24~48 h，待心肌细胞大部分伸展开连成一片，同步搏动时用于实验。

将培养的原代心肌细胞随机分为3组：1）空白对照组。2）模型组（H/R组）：缺氧9 h，复氧2 h。3）药物组：在培养基中分别加入终浓度为5、10、20 mL/L药物预孵育12 h后，缺氧9 h，复氧2 h。

取生长状态良好的原代心肌细胞，用含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化，制成2.5×10⁸个/L的细胞悬液，均匀接种到96孔板，每孔100 μL。24 h后，随机分为5组，每组6个复孔。正常组和模型组加入100 μL DMEM/F12基础培基，各给药组加入等体积终浓度分别为5、10、20 mL/L的药物。12 h后，换成条件培养基，正常组常氧条件下培养，模型组及给药组H/R处理，噻唑蓝法（MTT）检测细胞活力。

取生长状态良好的原代心肌细胞，用含EDTA的胰酶消化，制成2.5×10⁸个/L的细胞悬液，均匀接种到96孔板，每孔100 μL。24 h后，随机分为5组，每组6个复孔。加入不同浓度含有药物（5、10、20 mL/L）的培养基（正常对照组和双氧水（H₂O₂）模型组加入无血清DMEM/F12基础培养基）诱导12 h后，各组按条件处理。弃去各孔培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2次后，各孔加入100 μL CMH2DCFH-DA工作液，37 ℃ CO₂培养箱避光孵育30 min后，弃去工作液，用PBS清洗两次，每次5 min。每孔加入100 μL Hanks后上机检测，设定激发波长488 nm，发射波长525 nm。

同上述方法处理后的细胞，每孔加入100 μL JC-1 染色工作液，充分混匀，细胞培养箱中37 ℃孵育20 min。37 ℃孵育结束后，吸除上清，用JC-1 染色缓冲液（1×）洗涤2 次。加入100 μL 细胞培养液，上机检测。JC-1 单体的最大激发波长为515 nm，最大发射波长为529 nm；JC-1 聚合物的最大激发波长为585 nm，最大发射波长为590 nm。F=F（585/590）/F（515/529）。

具体方法参照超氧化物歧化酶测定试剂盒说明书操作。

取生长状态良好的原代心肌细胞，用含EDTA的胰酶消化，制成2.5×10⁸个/L的细胞悬液，均匀接种到6孔板，每孔2 mL。24 h后，随机分为5组，正常组和模型组加入100 μL DMEM/F12基础培基，各给药组加入等体积终浓度分别为5、10、20 mL/L的药物。12 h后，换成条件培养基，正常组常氧条件下培养，模型组及给药组H/R处理。加入Trizol裂解液，按RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。RT-PCR操作按试剂盒说明书进行。

实验数据用SPSS17.0软件包进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（±s）进行表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较若工齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法。P<0.05为差异有统计学意义。

与空白对照组相比，大株红景天注射液各剂量组给24 h后，对正常细胞活力无明显影响。结果见表1。

表1 大株红景天注射液对正常原代心肌细胞 活力的影响（±s） Tab.1 The effects of sofren injection on normal cell viability （±s）

组别	动物数	浓度（mL/L）	OD（A 450）
空白对照组	6	-	0.390±0.009
大株红景天注射液低剂量组	6	5	0.393±0.017
大株红景天注射液中剂量组	6	10	0.389±0.008
大株红景天注射液高剂量组	6	20	0.390±0.015

表选项

与空白对照组相比，H/R损伤后，细胞活力明显下降；而给予大株红景天注射液后，中、高剂量组与模型组相比细胞活力明显改善。结果见表2。

表2 大株红景天注射液对H/R损伤的原代心肌细胞活力 的影响（±s） Tab.2 The effects of sofren injection on cell viability with hypoxia-reoxygenation injury（±s）

组别	动物数	浓度（mL/L）	OD（A 450）
空白对照组	6	-	0.360±0.027
模型组（H/R组）	6	-	0.274±0.015##
大株红景天注射液低剂量组	6	5	0.279±0.008
大株红景天注射液中剂量组	6	10	0.308±0.026*
大株红景天注射液高剂量组	6	20	0.337±0.019**
注：与空白对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P< 0.01。

表选项

H/R损伤原代心肌细胞后，细胞内ROS产生明显增加，大株红景天注射液各剂量组与模型组比较，中、高剂量组抑制细胞内ROS产生的效果明显。结果见表3。

表3 大株红景天注射液对H/R 损伤的原代心肌细胞内 ROS生成量的影响（±s） Tab.3 The effects of sofren injection on ROS generation with hypoxia-reoxygenation injury（±s）

组别	动物数	浓度（mL/L）	ODOD（A488/525）
空白对照组	6	-	1452.33±069.42
模型组（H/R组）	6	-	2291.67±211.58##
大株红景天注射液低剂量组	6	5	2165.17±538.91
大株红景天注射液中剂量组	6	10	1794.33±160.90**
大株红景天注射液高剂量组	6	20	1294.00±120.13**
注：与空白对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P< 0.01。

表选项

H/R损伤后与空白对照组相比，原代心肌细胞线粒体膜电位明显降低；与模型组相比，大株红景天注射液中、高组可明显抑制细胞线粒体膜电位的降低，且呈现出一定的剂量依赖性。结果见表4。

表4 大株红景天注射液对H/R损伤的原代心肌细胞线粒 体膜电位的影响（±s） Tab.4 The effects of sofren injection on mitochondrial membrane potential with hypoxia-reoxygenation injury（±s）

组别	动物数	浓度（mL/L）	ODA（588/590）/A（515/529）
空白对照组	6	-	1.080±0.100
模型组（H/R组）	6	-	0.549±0.109##
大株红景天注射液低剂量组	6	5	0.693±0.161
大株红景天注射液中剂量组	6	10	0.741±0.094*
大株红景天注射液高剂量组	6	20	0.760±0.110*
注：与空白对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05。

表选项

与空白对照组相比，H/R损伤后原代心肌细胞内SOD活性减少；与模型组相比，大株红景天注射液中、高剂量组可明显增加SOD活性，且高剂量组效果更明显。呈现一定的剂量依赖性。结果见表5。

表5 大株红景天注射液对H/R 损伤的原代心肌细胞内 SOD活力的影响（±s） Tab.5 The effects of sofren injection on SOD vitality with hypoxia-reoxygenation injury（±s）

组别	动物数	浓度（mL/L）	SOD（kU/L）
空白对照组	6	-	15.529±0.787
模型组（H/R组）	6	-	9.469±0.682##
大株红景天注射液低剂量组	6	5	12.003±0.839
大株红景天注射液中剂量组	6	10	12.432±0.262*
大株红景天注射液高剂量组	6	20	14.764±0.266*
注：与空白对照组比较，##P<0.01；与模型组比较*P<0.05。

表选项

与空白对照组相比，H/R损伤后原代心肌细胞内SOD基因表达量减少；与模型组相比，大株红景天注射液组可明显增加SOD基因表达，且高剂量组效果更明显。呈现一定的剂量依赖性。结果见表6。

表6 大株红景天注射液对H/R 损伤的原代心肌细胞内 SOD 基因表达的影响（±s） Tab.6 The effects of sofren injection on SOD gene expression with hypoxia-reoxygenation injury（±s）

组别	动物数	浓度（mL/L）	SOD mRNA expression level
空白对照组	6	-	1.005±0.117
模型组（H/R组）	6	-	0.666±0.014#
大株红景天注射液低剂量组	6	5	0.861±0.074
大株红景天注射液中剂量组	6	10	0.867±0.039*
大株红景天注射液高剂量组	6	20	1.017±0.126*
注：与空白对照组比较，#P<0.05；与模型组比较*P<0.05。

表选项

近年来随着对心脏疾病的不断深入研究，发现心肌缺血再灌注损伤是导致心脏急性或慢性损伤的重要病理生理过程^{[9, 10]}。心肌缺血缺氧时，首先会引起能量代谢紊乱，三磷酸腺苷（ATP）生成减少，进而导致线粒体功能异常、线粒体膜电位降低、细胞内钙超载，同时细胞内生成大量氧自由基，而起到清除作用的SOD，导致氧自由基的大量堆积，再灌注或复氧时损伤进一步加重，最终导致心肌细胞凋亡^{[11, 12]}。氧自由基是人体内正常的代谢产物，但当其生成速度超过机体清除能力时，便会对细胞内DNA、蛋白质、脂质等几乎所有的生物分子造成破坏^[13]。

体外培养乳鼠心肌细胞造成缺氧/复氧模型是目前最为常用的模拟心肌缺血再灌注的细胞模型之一^[14]，细胞模型可以排除动物模型中神经、体液等因素的影响，直观可靠的观察药物对细胞的作用，具有特异性高、重复性好的特点^[15]。因此本实验选择乳鼠原代心肌细胞作为研究对象，缺氧9 h、复氧2 h作为模型，以便能更好的观察药物对心肌缺氧损伤的保护作用。

从实验结果可以看出，原代心肌细胞受到H/R损伤时，与正常组相比细胞活力明显下降，使用CMH2DCF-DA荧光探针直接检测细胞内ROS的生成，可以看到细胞内ROS的生成量明显增加，说明细胞受到氧化应激损伤后细胞内有大量氧自由基的堆积。给予大株红景天注射液预处理组ROS生成量明显减少，同时细胞活力明显提高，呈现出一定的浓度依赖性。提示大株红景天注射液可能减少氧自由基的生成直接清除氧自由基，从而保护细胞抗氧化应激损伤。SOD是机体内重要的抗氧化酶，能清除自由基，维持细胞的正常功能，SOD活力的高低可以反应机体抗脂质过氧化能力。大株红景天注射液预处理组与H/R损伤组相比SOD活力明显升高且SOD基因表达量增加，提示大株红景天注射液还可能通过增加SOD的活性和表达，间接清除氧自由基。研究证明可以抑制细胞内抗氧化酶类的药物均能增加细胞凋亡^{[16, 17]}。大株红景天注射液可通过清除氧自由基而增加细胞的抗氧化能力，阻断氧自由基介导的细胞凋亡，进而发挥其抗氧化的作用。实验结果显示，细胞受到H/R损伤后，线粒体膜电位明显下降，而大株红景天注射液预处理组可以明显抑制膜电位的下降，说明大株红景天注射液可以抑制由于氧化应激损伤导致的线粒体的损伤，维持线粒体的正常功能，这可能也是大株红景天注射液保护心肌细胞抗氧化应激损伤的机制之一。

综上所述，大株红景天注射液对缺氧/复氧诱导的心肌细胞的损伤有保护作用，但是此作用发挥的具体通路还有待进一步验证。