流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的高度传染的急性呼吸道疾病,具有传染迅速,死亡率高的特点｡复方龙芩草能够治疗由流感病毒引起的流行性感冒^[1],其喷雾剂具有解热､抗H1N1流感病毒的效果^{[2, 3, 4]},因喷雾剂易于产生沉淀,运用新的药物载体捕获复方龙芩草中抗H1N1流感病毒的药效组分,改进复方龙芩草的剂型可解决这一问题｡

微乳对不同极性的化学成分具有良好的增溶作用^[5]及提取效果^{[6, 7, 8]},在药物新剂型研发方面很有潜力^{[9, 10, 11]}｡本实验室自制的生物相容性微乳(空白微乳)是一种溶解性好､热力学稳定的体系^[12],能同时提取植物药和动物药成分｡在此基础上初步探讨生物相容性微乳和复方龙芩草微乳提取液体外抗H1N1流感病毒的作用,为研制新型的中药抗流感病毒的药物提供参考｡

人肺腺癌细胞(A549)由中国协和医科大学基础医学院提供｡甲型H1N1流感病毒,A1/黔防/166/85株,由中国中医科学院中医所提供,-75 ℃冷藏｡使用时接种于9 d龄鸡胚尿囊腔,35 ℃培养48 h,连续传代2次收集尿囊液,测定的血凝滴度为2^-7｡

地龙､黄芩均购自安国市神禾中药材饮片有限公司,经北京中医药大学中药鉴定教研室王晶娟副教授鉴定,地龙为钜蚓科动物通俗环毛蚓(Pheretima vulgaris Chen)的干燥体,黄芩为唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根｡甘草购自安国市祎澳中药饮片有限公司,经鉴定为豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)的根｡

McCoy's 5A培养基(gibco公司,美国);胎牛血清(gibco公司,美国);0.25%胰酶-0.02% 乙二胺四乙酸(EDTA)(北京普博欣生物科技有限公司),四甲基偶氮唑蓝(MTT)和二甲亚砜(DMSO)(Sigma公司,美国);三联溶解液:含十二烷基硫酸钠(SDS)10 g,异丁醇 5 mL,10 mol/L盐酸(HCl)0.1 mL｡细胞培养液:含有10%胎牛血清和1% 青霉素-链霉素混合物的McCoy's 5A培养基｡细胞维持液:含2 %胎牛血清和1%青霉素-链霉素混合物的McCoy's 5A培养基;胆固醇(美国SIGMA公司,批号MKBD9436V);PC50卵磷脂(上海太伟药业,批号20120301);猪胆盐(北京双旋微生物培养基制品厂,批号20120420);聚氧乙烯氢化蓖麻油(德国巴斯夫公司,批号512882);肉豆蔻酸异丙酯(美国SIGMA公司,批号172472);磷酸奥司他韦胶囊(达菲,瑞士巴塞尔豪夫迈罗氏公司,批号B1354)｡

细胞培养箱(BINDER WMK-02型);荧光倒置显微镜;光学显微镜;超净工作台(北京碧都净化设备有限公司);SHB-111型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);RO10型磁力搅拌器(德国IKA公司);水浴箱(北京医疗设备厂)｡

精密称取0.25 g胆固醇,溶于5.4 mL肉豆蔻酸异丙酯中,混匀后作为油相;称取18 g卵磷脂及等量的聚氧乙烯氢化蓖麻油,加入8倍量的95%乙醇溶解,加入油相后,再加入320 mL质量浓度为56.25 g/L的猪胆盐水溶液,磁力搅拌均匀即得黄色均匀透明的微乳｡

将复方龙芩草中地龙､黄芩､甘草分别粉碎,过6目筛,按照比例(1∶2∶1)精密称取40 g复方龙芩草置入500 mL烧杯中,加入200 mL微乳液,室温下避光放置24 h,再将浸润过的药粉装入渗漉桶,在水浴温度保持37 ℃的条件下以3~5 mL/min的流速渗漉,收集渗漉液,即得龙芩草微乳提取液｡

将A549细胞复苏,传代3~4次待细胞生长良好后用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化细胞,用细胞培养液调整细胞浓度为1.5×10⁸个/L,充分混匀后接种于96孔板中,100 μL/孔,放在35 ℃､5%的二氧化碳(CO₂)培养箱中孵育数小时使细胞单层铺满培养瓶底层｡用细胞维持液将微乳(以微乳含量计,初始浓度为1kg/L)､复方龙芩草微乳提取液(以微乳含量计,初始浓度为1 kg/L)和达菲分别连续10倍递次稀释,将各个浓度加入96孔板中,100 μL/孔,每个浓度平行6个复孔,同时设正常细胞对照组｡在35 ℃､5%的CO₂培养箱中培养48 h后观察细胞形态,从细胞形态较好,死亡较少的前一个浓度开始对倍稀释,将各个浓度加入96孔板中,100 μL/孔,每个浓度平行6个复孔,同时设正常细胞对照组｡相同条件下培养48 h观察细胞形态,加入MTT(终浓度为0.5 g/L),培养4 h后加入SDS,100 μL/孔｡再培养12 h于570 nm波长处测定细胞吸光度A,根据公式:细胞存活率%=实验组吸光度值(A)/细胞对照组吸光度值(A)×100% 计算细胞存活率｡采用SPSS 20.0软件中Probit回归计算药物半数中毒浓度(TC₅₀)｡

用无血清McCoy's 5A培养基对流感病毒H1N1进行连续10倍递次稀释,将各个浓度的病毒液接种到长满单层细胞的96孔板中,每个浓度6个复孔,100 μL/孔,同时设正常细胞对照｡37 ℃吸附2 h后以维持液代替病毒液,37 ℃､5% CO₂培养箱中培养48 h,在显微镜下观察细胞形态,记录病变程度和孔数,以细胞对照无明显病变,病毒感染细胞病变率达50%及以上的细胞孔为病变孔,按 Reed-Muench法计算病毒的TCID50｡

取已长成单层细胞的96孔培养板,吸出培养液,每孔加磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次,接种100TCID₅₀的病毒液,100 μL/孔,置37 ℃､5% CO₂培养箱中作用2 h后吸出病毒液,依次加入最大无毒浓度以下10个相应稀释度的空白微乳和复方龙芩草微乳提取液,设达菲为阳性药物对照组,正常细胞对照组和病毒对照组,每浓度4个复孔,100 μL/孔｡置37 ℃､5% CO₂培养箱中培养,显微镜下观察细胞病变情况,该实验验证2次｡细胞病变表示为:0%~25%(+),25%~50%(++),50%~75%(+++),75%~100%(++++),当病毒对照组细胞病变为 ++++ 时记录实验结果｡

取已长成单层细胞的培养板,吸除培养液,加入100 TCID₅₀的病毒液,100 μL/孔,置37 ℃､5% CO₂培养箱中吸附2 h后,吸除病毒液,加入最大无毒浓度以下对倍稀释的空白微乳和复方龙芩草微乳提取液,设达菲为阳性药物对照组,正常细胞对照组和病毒对照组,每浓度4个复孔｡继续培养48 h后加入MTT(终浓度为0.5 mg/mL),用酶标仪在570 nm波长下测定吸光度A值(A₅₇₀)｡计算药物抗病毒效率(ER),ER%=(药物组平均A值-病毒对照组平均A值)/(细胞对照组平均A值-病毒对照组平均A值)×100%｡

采用SPSS 20.0软件的Probit回归法计算空白微乳､复方龙芩草微乳提取液对细胞的半数抑制浓度(IC₅₀),并按照药物的治疗指数(TI)公式:TI=TC₅₀/IC₅₀计算药物的治疗指数,以上实验均重复3次以上,以均值±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用Dunnett's T3法,P<0.05为差异有统计学意义｡

空白微乳作用于A549细胞后,使细胞变圆,大部分从培养瓶底层脱落下来,折光性增加,在稀释100倍的浓度下细胞的形态有较大变化,形态改变､折光率增加的数量减少,与正常细胞组对比有一定的差异｡当稀释1 000倍时,与正常细胞相比,形态几乎没有变化,细胞均贴壁,仅有很少部分因培养瓶底层长满细胞无贴壁空间而处于悬浮状态;复方龙芩草微乳提取液在稀释1 000倍的药物浓度作用下,细胞的形态､贴壁状态等与阴性对照组无显著差异,受试药物100倍稀释浓度的对倍递次稀释浓度对细胞的毒性作用结果见表1｡

空白微乳和复方龙芩草微乳提取液的TC₀均为稀释800倍后的浓度,相当于1 250 mg/L(以含微乳量计);空白微乳的TC₅₀为6 982.869 mg/L(以含微乳量计),微乳提取液的TC₅₀为6 575.969 mg/L(以含微乳量计),相当于含生药1 315.194 mg/L,说明微乳提取了复方龙芩草后,提取液对细胞的毒性并未显著增加｡

通过观察加入病毒后A549细胞的病变状态,以Reed-Muench法计算H1N1流感病毒的TCID50为10^-3.778/0.1 mL｡

当空白微乳的浓度在1 250 mg/L时,细胞的存活率高于病毒感染组｡细胞的形态没有发生明显的变化,药物的细胞病变抑制率(ER)为67.57%,对部分细胞起到抑制病变的作用｡当浓度逐次减小,细胞形态发生改变,由梭形转变为狭长或其他无规则形状,细胞的破碎､折光率增加､变圆的病变程度越来越明显,存在一定的浓度依赖关系｡

复方龙芩草微乳提取液的浓度在625~1 250 mg/L时,细胞的存活率明显高于病毒感染组｡药物的ER>60%,药物的浓度依次减少,细胞变圆,破碎,不贴壁等现象逐渐增强,当浓度为312.5 mg/L时,细胞的形态呈现不规则狭长或分支状,其原因有待进一步探讨｡当浓度为1 250 mg/L时,细胞病变效应(CPE)最小,ER达到91.37%,细胞仅有轻微的变圆､不贴壁等现象,对病毒致细胞病变的保护作用最强,优于阳性对照药物达菲｡结果如表2｡

表2 微乳及复方龙芩草微乳提取液对H1N1 病毒CPE 的影响及ER (±s,n=4) Tab.2 Influences of blank microemulsion and microemulsion extract of cmpound Longqincao on CPE of H1N1 and their antiviral ER (±s,n=4)

组别	浓度(以含微乳量计)(mg/L)	CPE		ER(%)
		空白微乳	微乳提取液	空白微乳	微乳提取液
1	1 250.000	++	+	67.573±2.628△△	91.373±1.055##**
2	625.000	+++	++	46.240±3.267△△	67.019±1.604##**
3	312.500	+++	+++	36.970±2.645△△	44.366±3.991##*
4	156.250	+++	+++	27.588±0.973△	38.028±6.478#*
5	78.125	++++	++++	20.439±3.719	22.887±4.693##**
6	39.063	++++	++++	13.179±1.108	22.183±1.484
达菲	0.750	+	+	89.970±0.326	89.329±4.846
注:空白微乳与病毒对照组比较,△P<0.05,△△P<0.01;微乳提取液与病毒对照组比较,#P<0.05,##P<0.01;微乳提取液与空白微乳比较,*P<0.05,**P<0.01｡

表选项

由表2可知,在156.25~1 250 mg/L的浓度范围内,空白微乳和复方龙芩草微乳提取液与病毒对照组相比,具有显著的统计学差异,说明空白微乳和复方龙芩草微乳提取液均有抗H1N1流感病毒的效果｡复方龙芩草微乳提取液和空白微乳相比,在低浓度时,二者对病毒致细胞病变抑制率的差异并不明显,但随着浓度的增加,抗病毒效率差异逐渐明显,在浓度为625 mg/L和1 250 mg/L时,复方龙芩草微乳提取液具有很好的抗病毒效果,差异有统计学意义(P<0.01),可见复方龙芩草中主要有效成分经微乳提取后发挥出了应有的抗H1N1流感病毒的效果,空白微乳则起到了不容忽视的辅助作用｡

根据MTT的测定结果,运用SPSS 20.0软件的Probit回归法计算微乳､复方龙芩草微乳提取液对细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)和治疗指数(TI)｡结算结果见表3｡

甲型流感病毒易受地理因素､环境差异等影响,使亚型病毒株突破自身的基因约束和种属的屏障作用而发生突变并造成异种传播,使得甲型流行性感冒的严重程度不同,症状也因人而异,一些药物对甲型流感病毒的干预作用也变得相对困难,因此从中医药的角度出发,寻找能够发挥抗流感病毒效果的药物前体或潜在药物是解决上述问题的途径之一｡

本实验所制的生物相容性微乳以细胞膜的重要组成部分,胆酸､激素的合成原料胆固醇,生命体的基础物质卵磷脂､胆盐等作为表面活性剂及助表面活性剂,无论是空白微乳还是复方龙芩草微乳提取液,在稀释800倍(浓度1 250 mg/L,在稀释液中的含量为0.125%)的情况下对细胞几乎没有毒性,而Tween-80在灯盏花素注射液中的含量为0.8%,配成等同于注射液中的浓度稀释512倍(含量为0.001 6%)时对L929细胞仍有较大的毒性,稀释1 024倍(含量为0.000 8%)时对细胞基本无毒性^[13],PEG-400在40 mL/L时对Caco-2细胞基本没有抑制作用,在80 mL/L时仍表现一定的毒性^[14],可见由内源性物质胆固醇､卵磷脂等组成的生物相容性微乳对细胞的毒性明显小于Tween-80和PEG-400,在新型药物载体的辅料筛选和制备方面能够发挥较好的安全性,可以解决其他含有吐温类表面活性剂微乳的潜在安全隐患问题｡相同浓度的空白微乳和复方龙芩草微乳提取液对细胞病变的作用并无太大差异,可见所提取的复方龙芩草药效物质组对细胞的存活率(安全性)可能没有显著的影响｡

复方龙芩草微乳提取液具有较为显著的抗H1N1流感病毒的效果,在最大无毒浓度下对流感病毒致细胞病变的抑制率达到91.37%,TI为20.889,效果与达菲相似｡生物相容性微乳在一定程度上也能够发挥抑制病毒致细胞的病变作用,抑制率为67.57%,TI为9.078,据文献报道,胆固醇作为细胞膜的组成部分,可以通过改变病毒粒子与细胞膜的相互作用､维持细胞生物膜的流动性抑制病毒进入细胞^[15],而去除细胞膜胆固醇后使病毒从感染细胞中释放增加,但病毒粒子的感染性降低^[16]｡卵磷脂可以通过降低石英对细胞的毒性作用达到保护肺泡巨噬细胞的目的^[17],胆盐对不同细胞具有增殖作用^{[18, 19]}｡生物相容性微乳能够发挥一定的抗流感病毒的活性,可能和这些物质的特性相关｡与空白微乳相比,龙芩草微乳提取液表现出显著的抗H1N1流感病毒的优势,随着剂量的提高,差异愈加显著,当浓度为625~1 250 mg/L时,差异最明显｡由此可见,复方龙芩草微乳提取液的抗病毒效果应该是微乳与龙芩草复方协同作用的结果,微乳在提取液中起到一定的辅助作用,但是否增加了龙芩草复方药效物质的富集及疗效发挥,还有待进一步研究阐明｡

综上所述,本实验室自制的生物相容性微乳在一定程度上可以发挥抗H1N1流感病毒的效果,复方龙芩草微乳提取液体外抗H1N1流感病毒的效果显著,在病毒侵入细胞的过程中,发挥抗病毒的具体环节和机制有待进一步的研究｡