阿尔茨海默病（AD）又称老年性痴呆，是一种以记忆力减退为主要临床表现的常见中枢神经系统退行性疾病，主要病理特征为Aβ沉积和tau蛋白异常磷酸化导致的神经元丢失^[1]。益肾化浊方来源于张伯礼院士主持的国家“九五”科技攻关课题“益肾化浊法治疗老年期血管性痴呆的研究”基础上组方形成。前期研究结果表明，该方可改善AD患者认知功能^[2]，其组分具有诱导神经干细胞（NSCs）向神经元分化的能力^[3]。本实验拟从调控NSCs分化的关键基因Neurogenin1（ngn1）入手，初探益肾化浊方改善AD模型大鼠学习记忆能力的可能作用机制。

雄性SD大鼠50只，SPF级，体质量（200±30） g，购自北京大学医学部实验动物科学部（许可证号：SZXK（京）2011-00120）。

益肾化浊方组成：女贞子10 g，淫羊藿10 g，补骨脂10 g，石菖蒲12 g，炙黄芪10 g，川芎10 g。煎煮步骤及条件参照王凯等^[4]方法。制成生药浓度为0.62 g/mL，存于4 ℃冰箱。β样淀粉蛋白片段25-35（Aβ25-25，Sigma公司，批号：053M4804V），GFAP（abcam公司，批号: ab68428），Anti－Tubulin betaIII isoform（Millipore公司，批号：NAB1637），β－actin（CST公司，批号：4970s），Trizol（批号：R0016）、BeyoRT N－NuLV反转录酶（批号：D7159）、BeyoRT cDNA第一链合成试剂盒（RNase H－）（批号：D7166）、cDNA第二链合成试剂盒（批号：D7172）均购自碧云天公司、RT－PCR kit（Sigma公司，批号：GS0030）。

高速离心机Neofuge 13R（Heal Force 上海力申科学仪器有限公司），分光光度仪（上海坤肯生物化工有限公司），-80 ℃低温冰箱(Haier)，垂直板电泳转移装置(北京市六一仪器厂)，RG-3000型实时定量PCR仪（德国Qiagen公司）。

参照Miguel等^[5]方法制备Aβ25-35。模型制备参照杨晓娟等^[6]方法。

采用随机数字表法将50只大鼠随机分为5组，即假手术组、模型组、益肾化浊方低、中、高剂量组，每组10只。假手术组与模型组给予等体积生理盐水灌胃，益肾化浊方低、中、高剂量组参照徐叔云《药理实验方法学》^[7] 1 mL浓煎剂含0.62 g生药，故予益肾化浊方2.8，5.6，11.2 g/kg，灌胃每日1次，共灌胃4周。

取大鼠海马裂解提取总蛋白，测定蛋白浓度后采用Western blot凝胶电泳，转膜，封闭，一抗孵育，4 ℃静置过夜。洗涤后加入二抗孵育，充分洗涤后利用超敏ECL化学发光试剂盒，借助凝胶成像系统显影。图像结果采用image J软件分析。

按照Trizol试剂盒提取总RNA，每组总RNA浓度为1 g/L，1 μg RNA加入Oligod（T）7 μL及7 μL水，72 ℃变性10 min，取出立即置于冰上2 min。后加入反转体系6.5 μL，PCR仪中42 ℃反应50 min，50 ℃反应10 min。在逆转录体系中按试剂盒说明书进行逆转录反应，反应条件为：95 ℃，4 min后，执行95 ℃，30 s，56 ℃，30 s，60 cycles，观察荧光定量熔解度。引物序列见表1。

采用SPSS 17.0统计分析软件分析处理，计量资料均以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐用Dunnett’s T3以P＜0.05为有统计学意义。

Morris水迷宫检测发现与假手术组相比，模型组大鼠逃避潜伏期时间延长，穿越平台次数减少，而加入药物干预后，大鼠逃避潜伏期时间缩短，穿越平台次数增加，参照王凯等^[4]检测结果。

Western blot结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠海马区GFAP蛋白相对表达量显著升高，Tubulin蛋白表达显著下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，益肾化浊方低、中、高剂量组大鼠海马区GFAP蛋白相对表达量显著下降，Tubulin蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），但3组之间无统计学差异。见表2，图1。

表2 各组AD 大鼠海马区GFAP 和Tubulin 蛋白相对表 达量（±s） Tab.2 GFAP and Tubulin in the hippocampus of AD rats in each group（±s）

组别	动物数	剂量（g/kg）	GFAP/β-actin	Tubulin/β-actin
假手术组	10		0.70±0.08	2.13±0.17
模型组	10	-	1.27±0.03*	1.58±0.05*
益肾化浊方低剂量组	10	2.8	0.95±0.08#	2.73±0.05#
益肾化浊方中剂量组	10	5.6	0.91±0.09#	2.73±0.06#
益肾化浊方高剂量组	10	11.2	0.82±0.03#	2.96±0.06#
注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

表选项

图1 GFAP和Tubulin在海马区的表达 Fig.1 Expression of GFAP and Tubulin in the hippocampus 1：假手术组；2：模型组；3：益肾化浊方2.8 g/kg；4：益肾化浊方5.6 g/kg；5：益肾化浊方11.2 g/kg。

图选项

RT-PCR检测结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠ngn1基因相对表达量显著下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，益肾化浊方低、中、高剂量组大鼠ngn1表达量显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），但三组间比较无统计学意义。见表3。

表3 各组AD大鼠海马区ngn1基因相对表达量（±s） Tab.3 Expression of ngn1 in the hippocampus of AD rats in each group（±s）

组别	动物数	剂量（g/kg）	ΔCT	ΔΔCT	2-ΔΔCT
假手术组	10		3.99±1.23	0.00±1.23	1.00（0.43~2.35）
模型组	10	-	5.00±0.58	1.01±0.58	0.49（0.67~1.49）*
益肾化浊方低剂量组	10	2.8	3.31±0.59	-0.68±0.59	1.60（0.66~1.51）#
益肾化浊方中剂量组	10	5.6	3.00±0.72	-0.99±0.72	1.98（0.61~1.65）#
益肾化浊方高剂量组	10	11.2	2.79±0.88	-1.20±0.88	2.30（0.54~1.84）#
注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

表选项

Aβ沉积导致的神经元丢失是AD的主要病理特征，既往人们认为成年哺乳动物的中枢神经系统（CNS）缺乏再生能力，神经系统受损后不能通过神经细胞的增殖来替代丢失的神经元。而NSCs的发现为中枢神经系统退行性疾病的治疗提供了一条新思路。 NSCs既可向神经元分化，也可向星形胶质细胞分化，该过程会受相关信号转导通路及转录因子的调控^[8]。ngn1作为碱性-螺旋-环-螺旋基因（bHLH）家族成员之一，在NSCs分化过程中具有竞争性调控其向神经元分化的关键作用^{[9, 10]}。ngn1表达增加，既有利于启动神经元特异性基因Tubulin的表达，使NSCs进入神经元分化状态^[11]，又可以引起星形胶质细胞特异性基因GFAP的沉默^[12]，最终阻断星形胶质细胞的分化通路。因此适当增加ngn1基因的表达，进而调控NSCs向神经元方向分化以弥补其丢失，已成为减缓AD进展的潜在治疗方法。

前期研究发现，针对老年性痴呆肾精亏虚为本、痰浊瘀阻于脑络为标的病机特点^[13]，投用益肾化浊方切中肯綮^[2]。方中诸药合用下滋本元，上通脑窍，阴阳并补，标本兼治。现代研究也表明其组分具有促进神经干细胞增殖，并诱导其向神经元分化的作用^{[3, 14]}。但具体作用机制尚不清楚。

因此本研究从调控ngn1基因角度入手，对益肾化浊方改善的AD模型大鼠学习记忆能力的作用机制做一初探。结果显示，益肾化浊方治疗后显著增加了模型大鼠海马区ngn1基因的表达，进而减少了GFAP蛋白的表达，增加了Tubulin蛋白的表达，从而改善了其学习记忆能力。提示益肾化浊方改善AD模型大鼠学习记忆能力可能与增加ngn1基因的表达有关，而具体的作用机制尚需进一步研究。