慢性阻塞性肺疾病（COPD）以气道不完全可逆性气流受限为特征,可伴有气道高反应性,疾病呈进行性发展,与肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。气道黏液高分泌是COPD的重要病理特征,已被确立为影响COPD病死率和病情进展的独立危险因素,而黏液高分泌的结构基础是气管、支气管树杯状细胞化生^[1-3]。目前认为,杯状细胞化生主要依赖两个互补途径的持续激活:表皮生长因子受体（EGFR）-磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）-丝氨酸苏氨酸激酶（AKT）信号防止纤毛细胞的凋亡和白细胞介素-13（IL-13）信号促使细胞转分化,且TNF-α信号通路异常激活在杯状细胞化生、气道黏液高分泌过程中发挥关键作用^[4-6]。而所谓的气道黏液高分泌,就是中医学的“痰”。“痰”既是COPD重要的病理产物,又是其重要的致病因素。

本课题组以“黏液高分泌”或“痰”为切入点,采用单纯香烟烟熏法复制慢性阻塞性肺疾病大鼠模型,以临床常用的健脾益肺化痰系列方药进行干预治疗,在观察了健脾益肺方、化痰方及健脾益肺化痰方可显著改善COPD大鼠肺功能、血气及肺组织病理的基础上^[7],进一步观察健脾益肺化痰系列方对气道黏液高分泌关键信号分子的影响,探讨健脾益肺化痰系列方抑制COPD杯状细胞化生、降低气道黏液高分泌的效应机制及“痰”标本论治的差异性。

1 材料与方法 1.1 药物

采用临床治疗COPD常用的健脾益肺化痰系列方药,根据药物功效与归经分为3组。健脾益肺方:四君子汤合玉屏风散,组方:党参15 g,茯苓15 g,炙甘草5 g,白术10 g,黄芪15 g,防风6 g。化痰方:二陈汤加桔梗化裁方,组方:法半夏10 g,陈皮10 g,桔梗10 g,茯苓10 g,炙甘草5 g。健脾益肺化痰方:由四君子汤、玉屏风散、二陈汤加桔梗化裁方组成,组方:党参15 g,茯苓15 g,炙甘草5 g,白术10 g,黄芪15 g,防风6 g,法半夏10 g,陈皮10 g,桔梗10 g。实验中采用的阳性参照药物（西药）为羧甲司坦。

中药全部购自北京同仁堂医药药材有限公司,经北京中医药大学药用植物教研室鉴定均为正品。大鼠单位体质量生药量,在人体单位体质量生药量的基础上扩大10倍求得。各组药物分别以纯净水煎煮30 min,提取2次,再合并煎液,并将所得药液用双层纱布过滤,水浴加热蒸发浓缩,贮于冰箱中备用。羧甲司坦500 mg/kg灌胃,剂量参考文献[8]。

1.2 动物与分组

清洁级健康Wistar雄性大鼠,60只,鼠龄10~12周,体质量（180 ±20） g,购于北京维通利华实验动物公司,合格证号SCXK（京）2012-0001。动物适应性饲养7 d后,采用随机数字表法分组,分为正常组、模型组、健脾益肺方组、化痰方组、健脾益肺化痰方组、羧甲司坦组,每组10只。

各给药组动物,从吸烟第13周起,每日上午吸烟前0.5 h灌胃给予相应药液,连续用药28 d。正常组和模型组给予等量纯净水灌胃。各组于末次给药后,禁食12 h检测相关指标。

1.3 COPD大鼠模型的制作

参考文献[8],采用单纯香烟烟熏法制备慢性被动吸烟诱导慢性阻塞性肺疾病大鼠模型。模型组及各给药组大鼠放入自制被动吸烟玻璃熏箱,箱顶留有通气孔,燃烧大前门牌香烟,由三通管导入烟雾。一次熏烟燃烧大前门香烟12支,每支香烟约产生烟雾1 L,烟雾浓度约5%,持续0.5 h,每日吸烟2次,上下午各1次,每周5 d,连续16周。

1.4 试剂与仪器

大前门牌香烟,上海烟草公司,烤烟型,焦油量12 mg,烟气烟碱量0.9 mg,烟气一氧化碳含量14 mg;肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒,CUSABIO公司;磷酸化PI3K抗体购自Abcam公司;磷酸化EGFR抗体和磷酸化AKT抗体购自CST公司。动物熏烟箱（60 cm×50 cm×40 cm）,自制。

1.5 ELISA法检测肺泡灌洗液TNF-α的含量

肺泡灌洗液的收集:动物处死后,颈部正中切开皮肤,剪开肌肉后暴露气管,眼科剪尖端向心与颈部平面呈30°剪一小口,直径1.5 mm塑料软管行气管插管进入2 cm,双重棉线结扎固定。沿胸骨打开胸腔,暴露心肺,夹闭右主支气管,注射器吸取生理盐水与气管插管相连。用4℃冷藏的生理盐水灌洗左肺2次,30~60 s内缓注4 mL,在左肺停留30 s,4 mL两次,每次反复推抽2次,收集肺泡灌洗液（BALF）,轻揉胸廓促进灌洗液流出,注意动作轻柔,回收率可达90%。4 ℃ 1 000 r/min离心10 min,上清液-80 ℃保存待测。

ELISA法检测:按照试剂盒说明书进行操作,简述如下。分别设置标准品孔、待测样本孔,每孔加标准品或待测样本100 μL后,37 ℃温育2 h。弃液,加生物素标记抗体100 μL,37 ℃温育1 h。弃液,加辣根过氧化物酶标记亲和素100 μL,37 ℃温育1 h。显色,利用酶标仪在450 nm波长处测量各孔吸光度,从而求得浓度。

1.6 蛋白质印迹（Western Blot）法检测肺组织EGFR、PI3K和AKT磷酸化水平

总蛋白提取:取大鼠右肺组织约100 mg,加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂及蛋白磷酸酶抑制剂的混合液,超声破碎,离心收集的上清即为组织总蛋白。BCA法测定蛋白浓度,加入蛋白上样缓冲液,95 ℃变性后,-20 ℃冻存。

蛋白免疫印迹:取总蛋白100 μg,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转至PVDF膜,1%奶粉封闭后,加入一抗4 ℃过夜。一抗为兔抗大鼠磷酸化EGFR、PI3K和AKT（pEGFR、pPI3K和pAKT）,内参选用β-actin。二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的抗体,化学增强发光显影,X线胶片感光。计算机扫描胶片,用图像分析系统（Gel pro4.0版凝胶光密度分析软件）对蛋白条带进行半定量分析,灰度值代表蛋白含量。

1.7 统计学处理

采用SPSS 18.0统计软件进行分析,定量数据以均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较若方差齐采用LSD法,若方差不齐采用Dunnett’s T3法,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠肺泡TNF-α的检测结果

表 1显示,与正常组相比,模型组大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量显著增加（P<0.01）;与模型组相比,各给药组大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量均显著降低（P<0.01或P<0.05）,提示健脾益肺化痰系列方能抑制COPD大鼠肺组织炎性介质的分泌,降低杯状细胞化生及黏蛋白分泌的内源性刺激因子。各健脾益肺化痰系列方组间比较,TNF-α含量均未见显著性差异（P>0.05）。

2.2 各组大鼠肺组织EGFR、PI3K和AKT磷酸化水平

表 2显示,与正常组相比,模型组大鼠肺组织pEGFR、pPI3K和pAKT含量显著增加（P<0.01）;与模型组相比,健脾益肺化痰方组大鼠肺组织pEGFR、pPI3K和pAKT含量均显著降低（P<0.01）,而健脾益肺组仅pEGFR、pPI3K含量显著降低（P<0.01）,化痰方组仅pPI3K、pAKT含量显著降低（P<0.01）,提示健脾益肺化痰系列方药能抑制COPD大鼠肺组织EGFR、PI3K和AKT的磷酸化,下调气道黏液高分泌、杯状细胞化生关键信号分子的活性,作用以健脾益肺化痰方最佳。

3 讨论

气道黏液高分泌是COPD的重要病理生理学特征之一。黏液的过度分泌滞留于气道,一方面进一步加重气道阻塞,引起通气功能障碍,加速肺功能下降进程;另一方面也引起纤毛清除功能障碍,影响COPD患者对吸入细菌和有毒颗粒的清除,病菌定植,诱发反复感染,进一步刺激黏液高分泌的加重。这种感染和黏液高分泌相互促进的恶性循环机制,使COPD病人肺功能慢性不可逆性持续降低。临床研究表明,改善慢性阻塞性肺疾病患者气道黏液高分泌,是治疗COPD的有效途径^[9-11]。

TNF-α是气道黏液高分泌、杯状细胞化生的关键信号分子之一,也是COPD病情分级和疗效的生物学指征。COPD患者血清中TNF-α含量随患者疾病的严重程度增高,急性发作前高于缓解期,且用药治疗后显著下降^[12-14]。研究显示,烟雾等因素刺激下,TNF-α转化酶表达增加,可引起TNF-α分泌增加、转化生长因子-α含量升高,从而使表皮生长因子受体（EGFR）磷酸化增强,将刺激信号传向细胞内部^[15-18]。EGFR信号通路在COPD黏液细胞增生中主要发挥抗凋亡作用,其通过下游的PI3K/AKT磷酸化激活,特异性的保护小气道纤毛上皮细胞,使其免于凋亡,当使用特异性EGFR和PI3K抑制剂时,可观察到纤毛细胞的显著凋亡,这说明EGFR/PI3K是炎性因子刺激下,纤毛细胞成功存活并化生为杯状细胞、分泌黏液的分子基础^[19-20]。

本课题组前期研究证实,健脾益肺化痰方可显著减少COPD大鼠杯状细胞数量,降低黏液高分泌状态,但健脾益肺化痰方通过何种途径抑制杯状细胞化生、降低气道黏液高分泌,其内在机制还有待深入研究。因此,本实验选用健脾益肺方（治本）、化痰方（治标）及健脾益肺化痰方（标本兼治）,观察系列方对COPD大鼠气道黏液高分泌关键信号分子的影响,并对比分析三方对信号分子影响的差异。

本研究结果显示,与正常组相比,COPD组大鼠肺泡内TNF-α增加,肺组织EGFR、PI3K和AKT磷酸化增强,提示气道炎性因子分泌增加,且通过EGFR/PI3K信号通路,增强纤毛上皮细胞的抗凋亡能力,使其具备向杯状细胞转化的分子基础。与模型组比较,健脾益肺化痰系列方药组大鼠均表现出肺泡TNF-α降低,肺组织EGFR、PI3K和AKT的磷酸化水平显著降低或有下降趋势,提示健脾益肺化痰系列方药抑制杯状细胞化生、改善COPD大鼠气道黏液高分泌,与其抑制EGFR/PI3K信号通路有关。其中,健脾益肺化痰方组EGFR、PI3K和AKT的磷酸化水平均显著降低,而健脾益肺组和化痰方组EGFR、PI3K和AKT的磷酸化水平仅部分下降,提示健脾益肺化痰方（标本兼治）的抗黏液高分泌效果优于健脾益肺方（治本）、化痰方（治标）。因此,健脾益肺化痰系列方药均可通过TNF-α/EGFR/PI3K信号通路,抑制COPD大鼠气道杯状细胞化生及黏液高分泌,且“标本兼治”的作用优于单一“治本”、“治标”。

综上所述,健脾益肺化痰系列方通过TNF-α/EGFR/PI3K信号通路,抑制COPD气道上皮杯状细胞化生及黏液高分泌信号转导,进而抑制黏液高分泌,改善气道阻塞及减少病原菌定植,这可能是健脾益肺化痰系列方改善COPD的效应机制之一。本研究为健脾益肺化痰系列方治疗COPD的作用机制研究提供了有益的科学探索。