2016, Vol. 33文章信息
- 李晖 , 孙佳瑜 , 廖康汉 , 王喆 , 单爱云
- LI Hui , SUN Jia-yu , LIAO Kang-han , WANG Zhe , SHAN Ai-yun
- 虫草素抗炎作用及机制研究
- Anti-inflammatory effect and mechanism study of Cordycepin
- 天津中医药, 2016, 33(5): 303-306
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2016, 33(5): 303-306
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2016.05.12
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文章历史
- 收稿日期: 2016-02-23
2. 深圳市福田区中医院, 深圳 518033;
3. 中南大学湘雅医学院, 长沙 410013
虫草素即3’-脱氧腺苷（3’-deoxyadenosine）为核苷酸的衍生物，属于嘌呤碱，天然存在于冬虫夏草和蛹虫草（北虫草）中，是主要活性成分，为白色针片状结晶，其分子量为251.24。由苏格兰科学家Cunningham等在1951年首次从蛹虫草原浆液中分离得到[1],自从虫草素发现以来，国内外学者对其进行广泛研究，发现虫草素具有广泛药理作用和生物活性，研究中发现虫草素具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌等多种药理作用[2-7],对于虫草素的研究与开发，一直是国内外学者研究的热点，笔者主要通过建立体内外炎症模型研究虫草素抗炎作用和相应机制。
1 实验药品、材料与动物 1.1 药品与试剂主要化学药品和试剂虫草素（C3394，Sigma公司，美国），脂多糖（055：B5 L4005 sigma公司美国），前列腺素E2检测试剂盒（minneapolis，MN，美国），一氧化氮检测试剂盒（南京建成），COX-2和iNOS一抗（CST，美国），二抗和β-actin （Santa cruz，美国），DMEM细胞培养液（Corning，美国），胎牛血清（Hyclone，美国）
1.2 实验动物与细胞BALB/c小鼠，50只，体质量18~22 g，广东省医学实验动物中心提供。饲养环境为SPF级。随机分笼饲养。巨噬细胞RAW264.7细胞购买于协和医科大学细胞库。
2 实验方法 2.1 实验分组将50只BALB/c小鼠随机分为五组，分别为对照组、阳性药物组、虫草素高、中、低剂量组，给药途径为腹腔注射，对照组给等体积的生理盐水、阳性药物为赖氨匹林给药剂量为100 mg/kg，虫草素高、中、低给药分别为50、100、200 mg/kg，虫草素超声溶解在生理盐水中，每日给药1次，连续给药7 d。
2.2 二甲苯致小鼠耳肿胀各组小鼠末次给药后0.5 h，用二甲苯（200 μL/耳）均匀涂抹于小鼠右耳廓内外两侧致急性炎症，20 min后用小鼠耳廓打孔器将小鼠左右耳冲下等面积耳片，称质量后以自身的右左耳质量之差表示肿胀度。
肿胀度=自身右耳片质量－自身左耳片质量
2.3 耳片组织中NO和PGE2的含量测定将各组冲下来的耳片组织液氮冷冻后加入适量PBS仔细研磨，低温离心取上清[8]，分别检测研磨后组织上清液中NO和PGE2的含量。
2.4 虫草素对NO和PGE2产生的影响将RAW264.7细胞按密度5×106/孔平均铺于6孔板中，24 h后将不同浓度虫草素（12.5、25、50 μmol/L）和LPS（2 μg/mL）共孵育12 h，取细胞上清液，测其上清液中NO和PGE2的含量[8]，测定每孔细胞总蛋白量作为对比。
2.5 虫草素对iNOS和COX-2表达的影响将RAW264.7细胞按密度5×106/mL平均铺于6 cm平皿中，24 h后将不同浓度虫草素（12.5、25、50 μmol/L）和LPS（2 μg/mL）共孵育12 h后，提取每皿细胞总蛋白用免疫印迹检测iNOS和COX-2的表达情况[9]。
3 数据处理实验数据均以均数±标准差（x±s）表示，用ANOVA进行统计学检验,组间比较P<0.05视为差异有统计学意义。
4 实验结果 4.1 虫草素对小鼠耳肿胀的影响二甲苯致小鼠耳肿胀实验中，阳性药物赖氨匹林100 mg/kg给药后小鼠耳肿胀度为（6.21±1.81） mg（P<0.01）；虫草素低、中、高3个剂量（50、100、200 mg/kg）后小鼠耳肿胀度分别为（12.34±1.58） mg、（11.67±1.73） mg和（6.92±1.82） mg（P<0.05）；虫草素高剂量组与模型组比较有统计学差异，与阳性药物赖氨匹林作用大致相当，但中低剂量组对其肿胀没有抑制作用，见图 1。
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| 图 1 虫草素对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用 Fig. 1 Inhibitory effects of Cordycepin on xylene-induced ear swelling in mice 与模型组比较，*P约0.05，**P约0.01；x±s，n=10 |
取耳片组织匀浆后上清液，检测上清液中的NO和PGE2含量，实验结果提示，腹腔注射赖氨匹林100 mg/kg后小鼠耳片中NO的含量为（8.14±1.35） μmol/g（P<0.05），PGE2的含量为（122.45±8.72） mg/L（P<0.01）；虫草素低、中、高3个剂量（50、100、200 mg/kg）腹腔注射后小鼠耳片中NO分别为（14.25±1.81） μmol/g、（13.13±1.25） μmol/g和（9.15±1.67） μmol/g（P<0.05），见图 2，PGE2的含量分别为（238.52±13.54） mg/L、（222.17±10.12） mg/L、（132.15±12.17） mg/L（P<0.05）（见图 3），虫草素低、中剂量组对NO和PGE2的影响与模型组比较没有统计学差异，高剂量组与阳性药物大致相当。
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| 图 2 虫草素对小鼠耳片一氧化氮的抑制作用 Fig. 2 Inhibitory effects of Cordycepin on NO production in mice ear 与正常组比较，###P约0.001；与模型组比较，*P约0.05，**P约0.01；x±s，n=10 |
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| 图 3 虫草素对小鼠耳片前列腺素E2的抑制作用 Fig. 3 Inhibitory effects of Cordycepin on PGE2 production in mice ear 与正常组比较，###P约0.001；与模型组比较，**P约0.01，*P约0.05；x±s，n=10 |
LPS刺激RAW264.7细胞后，NO和PGE2的含量分别为（45.26±2.53） μmol/L和（90.96±2.68） mg/L与正常组比较有统计学差异（P<0.001）。虫草素3个剂量（12.5、25、50 μmol/L）给药后NO的含量分别为（40.7±2.35） μmol/g、（29.35±2.18） μmol/g（P<0.05）和（22.13±2.95） μmol/g（P<0.01），低剂量组的虫草素与模型组比较没有统计学差异（见图 4）；PGE2的含量分别为（88.27±2.93） mg/L、（60.97±2.51） mg/L（P<0.05）和（50.13±2.62） mg/L（P<0.05），低剂量组的虫草素与模型组比较无统计学差异（见图 5）。
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| 图 4 虫草素对RAW264.7细胞一氧化氮产生抑制作用 Fig. 4 Inhibitory effects of Cordycepin on NO production in RAW264.7 macrophages 与正常组比较，###P约0.001；与模型组比较，*P约0.05，**P约0.01；x±s，n=10 |
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| 图 5 虫草素对RAW264.7细胞前列腺素E2产生抑制作用 Fig. 5 Inhibitory effects of Cordycepin on PGE2 production in RAW264.7 macrophages 与正常组比较，###P约0.001；与模型组比较，*P约0.05；x±s，n=10 |
LPS刺激RAW264.7细胞建立细胞炎症模型，其iNOS和COX-2表达量与正常组比较有统计学差异（P<0.001）。不同浓度的虫草素（12.5、25、50 μmol/L）与LPS共刺激RAW264.7细胞后，中高剂量组与LPS刺激的模型组比较有统计学差异（P<0.05），结果提示虫草素能够抑制与炎症相关的iNOS和COX-2蛋白的表达。见图 6，图 7。
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| 图 6 RAW264.7细胞虫草素对iNOS表达的影响 Fig. 6 Effects of Cordycepin on iNOS expression in RAW264.7 macrophages 与正常组比较，###P约0.001；与模型组比较，*P约0.05；x±s，n=3 |
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| 图 7 RAW264.7细胞虫草素对COX-2表达的影响 Fig. 7 Effects of Cordycepin on COX-2 expression in RAW264.7 macrophages 与正常组比较，###P约0.001；与模型组比较，*P约0.05，**P约0.01；x±s，n=3 |
虫草素又称蛹虫草菌素，是冬虫夏草和蛹虫草里的活性成分，也是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌和调节免疫等多种生物活性[10]，自从虫草素发现以来，其广泛的药理作用和生物活性成为国内外研究的热点，开发前景广阔。炎症是机体对于致炎因子的防御性反应，炎症细胞和炎症介质参与的一些列的病理生理反应，在炎症反应中毛细血管通透性增加，炎性细胞趋化游走，炎性介质释放[11]。在炎症反应中，NO和PGE2是重要的炎性介质，参与和介导炎性反应，过量的产生NO和PGE2都会加重炎症反应对机体的损伤。研究认为NO是体内重要的细胞因子，参与包括有血管舒张、血小板聚集、神经传递、抗癌抗菌等过程，尤其是在炎症反应中能够介导产生炎症因子，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1等，具有细胞毒作用加剧炎症反应[12-13]，PGE2是重要的炎症介质之一，在炎症早期，PGE2能够促进血管舒张和增加神经对疼痛的敏感性，会增加炎症组织水肿和疼痛，同时也会增加其他炎症介质的作用如缓激肽的作用[14-15]，目前普遍认为NO和PGE2均参与炎症反应，加重炎症反应对机体的损伤，与急慢性炎症有密切的关系[16-17]，因此，抑制NO和PGE2的产生能够抑制炎症反应，减少炎症对机体的损伤，是抗炎的主要途径之一。iNOS和COX-2是产生NO和PGE2的限速酶[9]，抑制iNOS和COX-2蛋白的表达，能够抑制了NO 和PGE2的产生，发挥抗炎作用。本研究中通过二甲苯诱导小鼠耳肿胀建立急性炎症模型，给予浓度梯度虫草素发现能够抑制小鼠的耳肿胀以及炎性组织中NO和PGE2的产生，提示虫草素具有抑制炎症的作用，同时在RAW264.7细胞上，用LPS刺激建立细胞炎症模型，给予虫草素，实验结果提示虫草素能够抑制炎性相关蛋白iNOS和COX-2的表达和NO和PGE2的产生，综上所述，提示虫草素具有抗炎作用，虫草素的抗炎作用可能是通过抑制iNOS 和COX-2的表达和相应的NO 和PGE2的介导的。本实验研究表明虫草素具有抗炎的作用，这为虫草素的进一步的研究与开发提供了科学依据。
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2. Shenzhen Futian District Traditional Chinese Medicine Hospital, Shengzhen 518033, China;
3. Central South University Xiangya School of Medicine, Changsha 410013, China