蛇床子为伞形科植物蛇床Cnidium monnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果实。蛇床子性温、味苦，有小毒，具有燥湿祛风、杀虫止痒、温肾壮阳的功效，用于治疗阴痒带下、湿疹瘙痒、湿痹腰痛、肾虚阳痿和宫冷不孕^[1]。在临床上，外用治疗各种皮肤病及滴虫性阴道炎，手、足癣感染等疾病^[2]。现代药理研究发现蛇床子还具有一定防治骨质疏松及促进透皮吸收等作用^[3]，而其主要化学成分蛇床子素具有抗炎、免疫调节、促进神经干细胞增殖和分化以及抗肿瘤^[4-6]等作用。蛇床子主要含有蛇床子素、佛手柑内酯、花椒毒酚、花椒毒素、欧前胡素、异欧前胡素、异虎耳草素、哥伦比亚内酯等香豆素类化合物，倍半萜类挥发油，色酮类以及黄酮类化合物等成分^[7-8]，由于香豆素类化合物结构相似，为蛇床子化学成分分离以及测定增加了一定难度^[9]，故对其分析方法的优化不断涌现^[10-14]。本研究采用高效液相色谱法能够同时测定蛇床子中6 种香豆素类成分的含量，比较了不同批次样品含量差异，并建立蛇床子药材高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，计算各批药材相似度进行综合质量评价。

1 仪器与材料 1.1 仪器

Agilent 1200 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司），包括四元梯度泵，自动进样器，柱温箱，可变波长检测器（VWD）；十万分之一电子天平（METTLER TOLEDO）；BP121S 万分之一天平（德国赛托利斯公司）；SB-1000YDTD超声清洗槽（宁波新芝生物科技股份有限公司）；3K15离心机（德国Sigma公司）；中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；XW-80A旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂）。

1.2 试剂与药材 1.2.1 试剂

花椒毒素、异虎耳草素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素与异欧前胡素对照品均购买于成都曼斯特生物科技有限公司。甲醇为色谱纯（天津康科德试剂公司），甲酸（美国ACS恩科化学），其它试剂均为分析纯，水为超纯水（Millipore 公司，Mill-Q域型）。

1.2.2 药材

蛇床子药材17 批分别购自不同药店。蛇床子药材粉碎后过100目筛，备用。

2 实验方法 2.1 色谱条件

色谱柱Hedra ODS-2 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水（B）；流速为0.5mL/min。梯度洗脱程序为：0~5min，5~35%A；5~13 min，35~60% A；13~30 min，60~65% A；30~38 min，65~75%A；38~45 min，75~90%A；45~50 min，90% A；50~58 min，90~95%A；58~59 min，95~5%A；柱温为40℃；进样量为10 μL；检测波长为320 nm。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取花椒毒素、异虎耳草素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素对照品，均用甲醇配制为1 mg/mL 溶液，再分别吸取上述各标准品溶液一定量，并用甲醇稀释得到一系列不同浓度的混合对照品溶液，备用。

2.3 测定

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，进样，测定，即得。

2.4 正交实验设计

本实验设计考察了不同甲醇提取浓度（50%、75%、100%）、不同料液比（0.1 g/5 mL、0.1g/10 mL、0.1 g/20 mL）、不同提取时间（20 min、30 min、40 min）3 个因素对这6 个化合物提取总量的影响，根据正交设计软件采用L9（34）正交表设计正交实验^[15]。

2.5 供试品溶液的制备

精密称取蛇床子粉末0.05 g，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，超声提取40 min，所得溶液14 000 r/min 离心10 min，取上清，作为供试品溶液。

3 实验结果 3.1 方法学考察 3.1.1 线性关系考察

按照2.1 项下的色谱条件±次进样各浓度的混合标准品溶液，以对照品溶液的浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程，见表 1。结果表明，花椒毒素、异虎耳草素和佛手柑内酯在0.400~100 μg/mL内呈良好的线性关系，而欧前胡素、蛇床子素与异欧前胡素分别在0.800 ~200 μg/mL，1.600 ~400 μg/mL 和0.250~50 μg/mL内呈良好的线性关系。

3.1.2 精密度实验

取同一混合对照品溶液，按上述2.1 项下的色谱条件连续进样6 次，记录花椒毒素、异虎耳草素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素的峰面积，其相应峰面积的RSD 分别为0.97%、1.02%、0.79%、0.81%、1.20%和0.53%，表明仪器精密度良好。

3.1.3 重现性实验

取同一批次蛇床子药材粉末6份，精密称定，按上述2.1 项下的色谱条件测定，计算花椒毒素、异虎耳草素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素峰面积的RSD 分别为3.39%、3.20%、3.31%、3.24%、3.41%和4.88%，表明本方法重现性良好。

3.1.4 稳定性考察

取同一混合对照品溶液，按上述2.1 项下的色谱条件，分别在0、2、4、6、8、10、12和24 h 进样，计算6 种化学成分峰面积的RSD 分别为0.66%、0.83%、0.72%、1.08%、0.89%和0.70%，表明该样品溶液在24 h内稳定性良好。

3.1.5 加样回收率实验

精密称取已知含量的蛇床子粉末6 份，分别加入一定量的花椒毒素、异虎耳草素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素对照品溶液，按2.5 项下方法提取并进行测定，计算这6 种化合物的平均回收率，分别为101%、99.4%、99.4%、100%、97.7%和100%，结果见表 2。

3.2 样品含量测定

精密称取17 批蛇床子药材粉末，按照供试品溶液的制备方法制备不同批次供试品溶液，根据回归方程计算供试品溶液中6 种香豆素类化合物含量，结果见表 3。在测定蛇床子药材的6种化学成分中，蛇床子素含量最高，其次为欧前胡素，花椒毒素、异虎耳草素与佛手柑内酯，而异欧前胡素含量最低，且在S10、S11、S13 和S14 批次中，其含量未达到定量限要求，故未列出其含量。

3.3 指纹图谱的建立 3.3.1 指纹图谱的重现性、精密度和稳定性

取同一批次蛇床子样品6 份，按上述方法提取，进样并记录色谱图，计算各峰相对保留时间和峰面积，结果显示各峰相对保留时间的RSD 小于0.24%，相对峰面积的RSD 小于2.92%，表明该方法重现性良好；取同一份样品溶液连续进样6 次，计算其相对保留时间的RSD 小于0.24%，相对峰面积的RSD小于2.61%，结果显示精密度良好；取同一份样品溶液分别于0、2、4、6、8、10、12 和24 h 进样并记录色谱图，计算各峰相对保留时间的RSD 小于0.44%，相对峰面积的RSD小于2.89%，表明该样品于24 h内稳定^[16]。

3.3.2 指纹图谱的建立

将上述17 批蛇床子样品HPLC 色谱图进行指纹图谱分析，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）”软件生成对照指纹图谱，并进行数据处理^[17]，其HPLC 指纹图谱见图 2。该指纹图谱中有12个共有峰，其中可确认峰6所代表的化学成分为花椒毒素，峰8 为异虎耳草素，峰9 为佛手柑内酯，峰10 为欧前胡素，峰11 为蛇床子素。计算各批次蛇床子药材指纹图谱与生成的对照图谱R的相似度，结果见表 4。其相似度计算结果显示，17 批蛇床子药材指纹图谱相似度均大于0.980。

4 讨论

首先本实验采用正交实验对样品提取条件进行优化，比较该6种化学成分的含量，结果显示，0.1g蛇床子药材于20 mL 100%甲醇超声提取40 min 的条件下其总量最高，故应用此条件作为供试品的最佳提取条件。HPLC 测定不同批次蛇床子中6 种香豆素类化合物的含量，采用甲醇-0.1 %甲酸水进行梯度洗脱，分离效果较好，且峰形较佳。

目前传统HPLC 法同时测定香豆素类化合物的数目较少^[18]，故发展了液-质联用等方法对蛇床子进行定量^[19]，但其成本较高，而本实验采用HPLC 法即可对17 批蛇床子药材中6 种主要香豆素类化合物进行含量测定，结果显示，17 批蛇床子药材中蛇床子素含量均在11.3~50.0 mg/g（1.13%~5.00%）范围内，《中华人民共和国药典》规定，本品按干燥品计算，含蛇床子素不得少于1.0% ^[1]，即各批药材均符合中国药典规定。本实验以花椒毒素、异虎耳草素、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素和蛇床子素为指标，测定不同产地6 种香豆素类化合物的含量，该结果表明广西、安徽产蛇床子香豆素类化合物含量较高，即不同批次蛇床子其香豆素类化合物含量差异较大。中药指纹图谱能较全面地反映中药中所含化学成分的组成及含量分布情况，进而对药材质量进行整体描述和评价^[20]。通过采用高效液相色谱法测定6 种化学组分的含量，可得知不同批次药材中6种化学成分的含量差异，故采用中药指纹图谱从而全面分析17 批次药材间差异。根据相似度计算结果可以得知，与对照指纹图谱相比较，17 批蛇床子药材相似度均大于0.980，符合中药指纹图谱研究的技术要求。根据HPLC测定结果，可确定17批次药材有12 个共有峰，其中包括本实验已测定的化学成分，分别为花椒毒素、异虎耳草素、佛手柑内酯、欧前胡素与蛇床子素，故在采用HPLC 指纹图谱时可以与5 种化学成分为指标来全面评价蛇床子药材的质量差异，并为不同产地蛇床子样品之间的鉴别提供科学±据。

5 结论

建立了蛇床子中6 种化合物同时进行分离与测定HPLC 分析方法，该方法准确，简便、易行。同时建立了蛇床子HPLC 指纹图谱，可对不同批次蛇床子的质量差异进行全面评价，可为蛇床子质量控制研究提供一定参考。