目前认为慢性阻塞性肺疾病（COPD）的发病机制主要集中在炎症反应、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氧化应激和上皮细胞凋亡等方面^[1]。正常情况下，肺内细胞通过抗氧化系统的作用保持氧化/抗氧化平衡，但长期暴露于有害颗粒或气体时，有害成分使氧化作用过强和（或）抗氧化作用衰减时，就形成肺内氧化/抗氧化失衡^[2]。

益肺活血汤是已故中国工程院董建华院士治疗COPD的经验方剂，细胞实验研究证实能够降低由低氧诱导产生的细胞内低氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白高表达和活性氧（ROS）水平增高^[3]。本课题将观察益肺活血汤对大鼠COPD 模型病理和肺功能的影响，并通过研究该药对大鼠COPD 模型肺组织中谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量，转录因子红细胞系-2p45（NFE2）相关因子-2（Nrf2）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）蛋白及mRNA表达的影响从而评价其在氧化/抗氧化失衡机制方面的干预效应。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂

口鼻式吸入暴露染毒系统（柴田科学株式会社）、香烟烟雾发生器（柴田科学株式会社）、AniRes 动物肺功能分析系统、LOGENE PAS900病理图像分析系统(无锡朗伽生物工程有限公司)、红梅牌香烟（每支烟气烟碱量0.9 mg，焦油量11 mg，烟气一氧化碳量12 mg）、脂多糖（LPS）、9 号直头灌胃针、总谷胱甘肽检测试剂盒（碧云天公司）、MDA检测试剂盒（碧云天公司）、总SOD活性检测试剂盒（碧云天公司）、引物由北京博迈德科技发展有限公司合成。

1.2 实验用药

黄芪100 g，党参120 g，白术60 g，当归90 g，桃仁120 g，红花90 g，牛膝80 g，川芎50 g，赤芍60 g，陈皮70 g，柴胡50 g，桔梗50 g，枳壳60 g，甘草30 g，加重蒸水1 500 mL，同时煎沸20 min,合并两次滤液4 000×g离心15 min 后取上清液，浓缩至每1 mL含生药1 g。分装灭菌，备用。

1.3 动物

SPF 级雄性SD 大鼠40 只，体质量（250±20）g，鼠龄10周。

2 实验方法 2.1 动物分组及模型制作方法

分组：将大鼠按照体质量由低到高排序,依次采用Excel 随机分配无重复的大于等于1 的整数,再按照所分配数值由小到大重新排序。第1~10只分配至对照组、11~25只分配至COPD组、26~40 只分配至益肺活血汤组（以下简称中药组）。

对照组：第1、14 天，用1%戊巴比妥（缘0 mg/k早）腹腔注射麻醉,仰卧固定于操作台。外部以聚焦光源照射颈部。撑开口腔后腹侧方向可见随呼吸一开一合的声门,以9 号直头灌胃针快速插入气管,将生理盐水200 μL 注入气管内。气管注入后以轴位旋转大鼠数次。室内环境饲养28 d。第2天起灌服0.9%氯化钠溶液（3.3 g/k早，每日2 次），第14 天不灌服，共26 d。第29 天行肺功能检查并处死动物留取肺组织。

COPD 组：第1、14 天,以上述气管注射方法将LPS（1 g/L）200 μL注入气管内。气管注入后以轴位旋转大鼠数次。第2~13、15~28天每天上午在口鼻式吸入暴露染毒系统内熏吸香烟烟雾。香烟烟雾产生于香烟烟雾发生器内。每次同时燃烧10支香烟，每吸15 mL，每支香烟以每分钟1 吸的速度共8 吸，前后用时64 min，共燃烧84支香烟,烟雾浓度约40%（V/V）。第2 天起灌服0.9%氯化钠溶液（3.3 g/kg，每日2 次），第14 天不灌服，共26 d。第29 天行肺功能检查并处死动物留取肺组织。

中药组：以COPD 组方法制备模型。第2 天起灌服益肺活血汤3.3 g/kg，每日2 次，该剂量系此前相关实验所提示大鼠模型有效剂量^[3]。第14天不灌服，共26 d。第29 天行肺功能检查并处死动物留取肺组织。

2.2 检测方法及步骤 2.2.1 肺功能检测

用1%戊巴比妥（50 mg/k早）腹腔注射麻醉,仰卧固定于操作台。于颈部正中剪开皮肤后逐层分离肌肉组织并暴露气管。在气管上段行T行切口并插入气管插管，以缝线打结固定。将大鼠置入肺功能检查仪器当中，气管插管与机器接口连接。按机器操作程序测定大鼠第0.3 秒用力呼气容积（云耘灾园援猿）（单位mL）、用力肺活量（FVC）（单位mL）、FEV0.3/FVC。

2.2.2 肺组织留取

将大鼠放血处死,将气管与双肺暴露。取右肺组织置于-80℃冰箱中拟行GSH、MDA、SOD 含量测定，Nrf2和γ-GCS 蛋白免疫印迹检测（Western blot）及Nrf2 和γ-GCS mRNA 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）。取左肺组织浸入4%多聚甲醛（含1%DEPC）中固定,常规石蜡包埋,切片行苏木精-×红（HE）染色及免疫组化监测。

2.2.3 GSH、MDA 和SOD 含量测定

大鼠肺组织与生理盐水10%组织匀浆在12 000×g 下离心5min，取上清液，用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，然后按照试剂盒说明书操作步骤，使用可见光分光光度计检测大鼠肺组织GSH、MDA及SOD 含量（单位分别为mg/mg、mmol/mg、U/mg）。所有实验至少重复2次，每个水平5 个重复，实验结果以平均值附标准差表示。

2.2.4 HE 染色

用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度乙醇，最后入蒸馏水，就可染色。1）将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。2）酸水及氨水中分色，各数秒钟。3）流水冲洗1 h后入蒸馏水片刻。4）入70豫和90豫乙醇中脱水各10 min。5）入乙醇×红染色液染色2 min。染色后的切片经纯乙醇脱水，再经二甲苯使切片透明。将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标笺，切片标本就可使用。

2.2.5 免疫组化检测

用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度乙醇，最后入蒸馏水，就可染色。切片放在Hydrogen Peroxide Block 中孵育10~15 min，磷酸盐缓冲液（PBS）洗5 min，2次。滴加山羊血清，室温孵育30 min。按抗生蛋白链菌素-过氧化物酶（SP）检测试剂盒操作，滴加一抗工作液37益孵育1h。滴加HRPPoly皂藻则（酶标二抗）。向1mLDABPlusSubstrate中滴加1~2滴DABPlusChromogen，混匀后滴加到切片上，孵育2 min。自来水充分冲洗,复染，脱水，透明，封片。LOGENE PAS900 病理图像分析系统（无锡朗伽生物工程有限公司）采集和分析图像,检测平均吸光度值（粤），取平均值作为每只动物阳性表达的相对强度。

2.2.6 Westernblotting 检测

于液氮中取出大鼠肺组织，按照试剂盒说明书，提取组织浆蛋白和核蛋白,并依据BCA法蛋白质含量检测试剂盒说明测定蛋白浓度。严格按照Western blotting 操作步骤及要求操作。8%分离胶、5%的积层胶；γ-GCS、Nrf2玉抗以1颐200封闭液稀释,域抗以1颐1 000稀释,增强化学发光法载胶片显影定影后扫描至计算机,图像分析系统计算待测条带的吸光度×面积，与其内参照茁-action（细胞内稳定表达的蛋白质，用于与目的蛋白质对比的参照物）条带的吸光度×面积的比值，作为其蛋白质表达水平的相对指标。

2.2.7 RT-PCR检测

右下肺组织加入1 mL Trizol,研磨成匀浆，室温裂解5 min。提取RNA。将RNA模板浓度统一调至500 μg/L。按试剂盒说明进行反转录合成cDNA，用Primer Premier 5设计目的基因、内参基因茁-actin 的引物，将设计好的引物送交北京博迈德科技发展有限公司合成。引物序列如下，见表 1。

然后配置PCR 反应体系：SYBR Premix ExTaq^TM Ⅱ（2×）10 μL；PCR 上游引物（10 μmol/L）0.8 μL；PCR 下游引物（10 μmol/L）0.8 μL；ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL；cDNA 3 μL；dH₂O₅μL。Real Time PCR反应条件为：Stage 1：预变性5℃，30 s；Stage 2：PCR 反应，Reps：40；95℃，5 s；60℃，34 s（采集荧光）Dissociation Stage：95℃，15 s，60℃，60 s；95℃，15 s。将管家基因茁-actin作为内参对照，以样品目的基因得值与样品内参基因得值比值，得出样品目的基因相对mRNA表达量值。

2.3 统计学方法

采用SPSS 18.0 统计软件，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，进行单因素方差分析。以P<0.05 为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 大鼠死亡情况

对照组，死亡2 只，原因考虑气管注入生理盐水过程中窒息死亡。COPD组死亡5只，3 只系气管注入生理盐水过程中窒息死亡，2只系吸烟过程中动物自行掉头后窒息死亡。中药组死亡1只，系气管注药物过程中窒息死亡。

3.2 肺功能检查

结果见表 2。

3.3 HE 染色肺组织光镜结果

见图 1。对照组肺泡未见扩张，结构正常，间质未见炎症细胞浸润，细支气管周围无炎症细胞浸润（图 1A）。COPD组细支气管黏膜上皮细胞变性、坏死。肺泡壁变薄，肺泡腔扩大、破裂或形成大泡。细支气管壁有炎症细胞浸润（图 1B）。中药治疗组可显著缓解COPD组的病理改变（图 1C）。

3.4 GSH、MDA和SOD

含量见表 3。

3.5 RT-PCR 检测Nrf2 mRNA 和γ-GCS mRNA 表达

结果见表 4。

3.6 Nrf2 和γ-GCS 蛋白表达 3.6.1 免疫组化切片光镜结果与对照组比较，

COPD 组大鼠肺组织中γ-GCS 在支气管和肺泡上皮细胞、炎性细胞以及平滑肌细胞中都为高表达，Nrf2 在气道上皮细胞中表达增多。与模型组比较，中药组肺组织中γ-GCS或Nrf2表达均减少。半定量分析结果见表 5。

4 讨论

目前认为细胞毒性产物MDA 可以反映COPD患者组织细胞氧化损伤程度^[2]，而GSH 是肺内抵御氧化应激的关键抗氧化剂，SOD 则是重要的抗氧化酶^[4-5]。γ-GCS是GSH合成的限速酶，多项实验研究发现在COPD 动物模型和患者的肺组织中γ-GCSmRNA、γ-GCS 蛋白含量都是增加的^[6-9]。Nrf2 是调节抗氧化系统的重要转录因子，在氧化剂作用下Nrf2活化并由胞浆进入细胞核，从而上调γ-GCS表达，促进抗氧化物GSH的生成，在COPD的发展过程中起保护作用^{[4, 6-7, 10]}。

益肺活血汤是已故中国工程院董建华院士治疗COPD 的经验方剂，多年来一直应用于COPD 和肺源性心脏病治疗，疗效显著^[11-12]。细胞实验研究证实益肺活血汤能够降低由低氧诱导产生的细胞内HIF-1α蛋白高表达和ROS水平增高，从而抑制低氧诱导的PASMCs增殖^{[3, 13]}。其中对ROS 的干预效应提示益肺活血汤可能具有抗氧化的生物效应。

本实验采取香烟烟雾吸入联合气管内注射脂多糖方面制备大鼠COPD模型。肺功能结果显示，与对照组比较COPD组存在持续的气流受限。而肺组织HE 染色切片可见支气管黏膜上皮细胞、纤毛、肺泡的广泛病变，炎症细胞浸润，管壁黏液腺及杯状细胞增生、肥大。结合中华医学会发布的慢性阻塞性肺疾病诊治指南认为大鼠COPD模型制备成功^[1]。

COPD 组大鼠MDA 显著增高说明肺组织内存在严重细胞氧化损伤，这与目前认为COPD 发病机制中存在氧化/抗氧失衡一致。而肺组织中Nrf2 和γ-GCS mRNA 和蛋白增加、GSH 水平增高说明COPD 组大鼠肺组织受香烟烟雾刺激后抗氧化系统反应性上调———Nrf2 激活、γ-GCS 上调和 GSH 增多。这与以往研究中所提示的COPD氧化/抗氧化失衡中Nrf2 的激活、开启Keap1-Nrf2-ARE 信号通路、促进抗氧化物GSH的表达，从而抵抗氧化损伤、在COPD的发展过程中起保护作用的结论一致^{[4, 6-7, 10]}。但以往也有研究提示Nrf2 激活体现在蛋白水平而非mRNA 水平^[7]，本实验结果中模型组Nrf2 mRNA水平的增高与这一结论并不一致。模型组SOD的显著减少则说明在氧化应激的过程中存在着过氧化物酶活性的受损。既往的研究已经提示无论是在COPD 患者还是动物模型当中都存在这种SOD 受损现象^{[2, 14-15]}，也有研究采用基因敲除动物模型的方法发现SOD 基因缺陷会加重吸烟或气管内注射弹性蛋白酶诱发的肺气肿和细胞外基质破坏^[5]。

与COPD 模型组比较，治疗组在肺功能方面显著改善，支气管上皮细胞和纤毛病变、肺气肿、炎症细胞浸润等病理变化也显著减轻。治疗组MDA降低、Nrf2 和γ-GCS 的mRNA和蛋白、GSH含量降低。这说明通过益肺活血汤的治疗，肺组织细胞氧化损伤减轻。而Nrf2 与keap1 解离减少、Keap1-Nrf2-ARE信号通路作用减弱则应当是肺组织细胞氧化应激减轻后的反应性变化。这也提示益肺活血汤对氧化损伤的保护作用可能并非是通过激活Keap1-Nrf2-ARE 通路、引起γ-GCS 基因和蛋白水平上调、GSH增多得以实现。另一方面益肺活血汤组肺组织SOD含量的增多，则提示该药的抗氧化作用可能是通过提高肺组织SOD的含量得以实现。目前关于COPD 发病机制中SOD 作用的相关研究认为真正发挥抗氧化作用的是位于细胞外的SOD3^{[5, 16-17]}。下一步实验在重复益肺活血汤改善动物模型肺功能及病理改变的同时，可研究益肺活血汤对SOD3的影响从而进一步探明益肺活血汤的作用机制。

本实验的不足之处在于实验过程中动物死亡偏多，导致最终标本例数偏少。下一步可在增加实验动物数目、熟练操作技能的前提下重复本实验，从而验证实验结果。本实验仅仅采用了3.3 g/kg 这一个剂量组，不利于证实药效作用。这主要是因为在既往实验^[3]中该剂量对大鼠显示出生物学效应，而既往实验中较低的一个剂量组（0.66 g/kg）并未显示出生物学效应。而既往实验中较高的另一个剂量（16.5 g/kg）虽然显示了明显生物学效应，但在本研中由于大鼠体质量较既往实验中大，造成此剂量下药物体积大、灌胃难度大且预实验中死亡率高，最终放弃该剂量实验。未来的动物实验中应探索使用其他剂量，从而更充分的证明药效。