中医学家张仲景在其《伤寒杂病论》中记载葛根芩连汤具有降糖和改善糖尿病病变程度的功效^[1-3]。葛根芩连汤主治表证未解，邪热入里证，由葛根、黄芩、黄连和炙甘草4 味中药组成。实验研究表明葛根芩连汤不仅能够降低多种糖尿病动物模型的血糖值，还能够改善糖尿病并发症^[4-7]。葛根芩连汤各单味药及全方中，成分均较复杂，其含有小分子化合物及微米、纳米尺度的颗粒物质，能表现出不同的细胞活性^[8-9]。本研究通过制作链脲佐菌素（STZ）糖尿病模型，探讨中医药在改善糖尿病大鼠血糖、血清胰岛素及血脂等指标中的作用，以期观察葛根芩连汤对糖尿病大鼠早期视网膜病变的治疗作用，为葛根芩连汤的应用提供实验依据，也为糖尿病视网膜病变的防治提供一种新方法。

1 实验动物与主要试剂 1.1 实验动物健康

SD 大鼠45 只，鼠龄为1 月龄，雌雄不限，体质量（220~260）g，于恒温下饲养，自由饮水和进食，实验前1 天禁食不禁水。实验中对动物处置方法符合动物伦理学要求。SD 大鼠购自辽宁医科大学动物实验中心，动物质量合格证号：SCXK（辽）20050002。

1.2 主要试剂

STZ 由北京北京莱博赛斯生物科技有限公司购进；甘油三酯（TG）测定试剂盒由美国Sigma 公司提供；高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）与测定试剂盒（PTA-Mg²⁺沉淀法）均购自美国Santacruz公司；TUNEL凋亡检测试剂盒购自大连宝生生物公司；罗氏血糖仪由北京赛百盛基因技术有限公司提供；Optium 试纸（Abbott Diabetes Care Ltd）由美国SANTA 公司产品提供，免疫印迹（Western blot）法反转录试剂盒购自TaKaRa 公司；AMV 逆转录试剂盒由杭州博日提供；ICAM-1 抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；PKB抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；石蜡切片机购自北京天根生化有限公司；超净工作台由苏州安泰空气技术公司提供；眼科显微器械购自Thermo Forma 公司；荧光倒置显微镜由德国Leica 公司提供；葛根、黄芩、黄连、甘草购自北京同仁堂饮片有限责任公司提供。

2 方法 2.1 大鼠糖尿病模型制备及实验分组

将45 只SD大鼠给予高脂高糖饲料4 周后，按45 mg/kg的剂量腹腔1 次性经尾静脉注射STZ（用前溶于柠檬酸盐缓冲液，pH 4.5），注射后2 周内用快速血糖仪连续2次、间隔至少2 d测大鼠尾端空腹血糖，血糖连续两次≥16 mmol/L,且出现多饮、多食、多尿表现，体质量减轻者为糖尿病模型成功。建立后采用随机数字表法分为DM 组（糖尿病组）、DM+NS组（糖尿病生理盐水注射组）和实验组（DM+葛根芩连汤组）。模型建立后，阅酝组不做任何处理，实验组给予葛根芩连汤8.2 g/kg，DM+NS 组注射等体积的生理盐水。

2.2 各组糖尿病大鼠血糖、体质量、血胰岛素、TG和HDL-C 含量变化检测

对大鼠体质量进行动态测定。隔夜禁食10 h 后采用罗氏血糖仪进行大鼠尾端空腹血糖的检测。血胰岛素由辽宁医科大学动物实验中心生化室及核医学同位素室检测。抽取各组大鼠尾静脉血，离心后取血清，测定血清中栽郧和HDL-C 的含量，方法见试剂盒说明书。

2.3 Westem blot 法检测蛋白激酶B（PKB）以及细胞间黏附因子-1（ICAM-1）的表达情况

于显微镜下去除眼前节，然后小心分离视网膜，将视网膜组织放入1 mL EP 管中，弃去上清,加入1 μL 的苯甲基磺酰氟（PMSF）裂解液，摇匀置于冰上超声裂解，裂解30 min，4℃条件下14 000 r/min（r=8 am）离心5min。磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞3 次，提取总蛋白，应用BCA法测定蛋白浓度。吸取50 μg总蛋白，去离子水补至20 μL，入等体积2×上样缓冲液，以5%浓缩胶40 V衡压1 h，以10%分离胶60 V恒压3.5h，湿转14 V恒压14 h，37℃下摇床封闭2 h，分别加入1颐1 000 稀释的PKB 及ICAM-1一抗4℃过夜，次日，膜用三乙醇胺缓冲盐水溶液（TBS-T）洗涤3次，每次10 min，洗膜后加入二抗放入1颐5 000 HRP标记的二抗及GAPDH，37℃摇床孵育60 min。TBST 洗膜5 min，4 次。二甲基联苯胺（DAB）显色，实验重复3 次。用超敏ECL法检测。最后暗室曝光X线片，冲洗胶片，Image-Pro Plus 8.0软件软件分析条带灰度值检测，PKB 及ICAM-1 与GAPDH 的比值作为PKB 及ICAM-1 相对表达量。

2.4 糖尿病大鼠的视网膜超微结构观察

大鼠于乙醚麻醉状态下断髓处死，以碘酒3 点位标记，迅速摘除眼球，清除眼前段组织，小心分离视网膜，将视网膜组织用4豫戊二醛固定固定24 h，4益保存，做石蜡切片，用二甲苯脱蜡后，±次浸入梯度乙醇（70%、80%、95%、无水乙醇）中进行脱水处理。然后用蒸馏水清洗切片2 min，放置于苏木素染液中浸泡10 min，再用蒸馏水清洗切片，随后浸入梯度乙醇，用×红乙醇溶液染色后，通过二甲苯透明。树胶封片，放置于恒温箱中干燥后于显微镜下观察，并摄像。显微镜下每张切片于受损脑组织区取不重复的5 个视野，观察各组脑组织病理学形态变化。

2.5 TUNEL法检测凋亡相关蛋白C-myc 的凋亡指数

将石蜡切片脱腊后，用梯度乙醇进行脱水处理，采用PBS 液清洗5min，用4%多聚甲醛固定细胞15 min，再经PBS 液清洗2 次每次清洗时间为5min，用20 mg/L Proteinase K通透细胞15 min，PBS 浸洗5min，浸入4%多聚甲醛固定5 min。加入100 μL的平衡液平衡10 min，于37℃下与TUNEL混和液反应60 min，经PBS 清洗5 min 共3 次，加入DAB 混合液避光显色，用苏木素复染后自来水冲洗，利用梯度乙醇脱水。采用二甲苯透明1 min，2 次，中性树胶封片，拍照，显微镜下于每张切片选取5 个视野（×400）计数500 个细胞，求得阳性细胞百分率，计算细胞凋亡指数。

2.6 统计学分析

采用SPSS 18.0 软件包进行处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示。比较治疗前后用配对t 检验，组间比较采用单因素方差分析，重复测量设计采用重复测量方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 各组糖尿病大鼠血糖、体质量、血胰岛素的变化

给药后6 周，与DM组和DM+NS 组比较，实验组大鼠空腹血糖明显降低、体质量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。与阅酝组和阅酝垣晕杂组比较，实验组大鼠血胰岛素含量增加，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表 1。

3.2 各组大鼠TG 和HDL-C 含量变化比较

给药后2 周，与DM 组和DM+NS 组比较，实验组大鼠TG 明显降低（P<0.05）。与DM组和DM+NS 组比较，实验组HDL-C明显升高，见表 2。

3.3 Westem blot 法检测

PKB 以及ICAM-1 的表达情况给药后2 周，通过Westem blot 检测可见与DM组和DM+NS组比较，实验组大鼠PKB 的表达明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。与阅酝组和阅酝垣晕杂组比较，实验组大鼠陨悦粤酝原员的表达明显下降（P<0.05）。见图 1。

3.4 糖尿病大鼠的视网膜超微结构观察

给药后2周，对视网膜切片HE 染色行超微结构的检查：DM组可见细胞水肿，核固缩、浓染，核膜内陷，染色质边集，可见大部分或全部的嵴消失，凋亡小体出现，部分双侧膜融合。DM+NS 组：可见细胞质出现水肿，粗面内质网扩张明显，脱颗粒明显。与DM组和DM+NS 组比较，实验组细胞水肿程度减轻，各种视网膜病变程度明显减轻（P<0.05），见图 2。

3.5 TUNEL法检测凋亡相关蛋白C-myc的凋亡指数

TUNEL法结果可见，各组大鼠视网膜凋亡相关蛋白C-myc 的表达变化比较，与DM 组和DM+NS组比较，实验组中凋亡相关蛋白C-myc 明显减少（P<0.05）。表明糖尿病大鼠视网膜组织表达的Cmyc可能参与了视网膜神经细胞的凋亡。C-myc 凋亡指数的改变，可能与糖尿病视网膜病变密切关联。各组大鼠不同时间点C-myc 的表达变化比较，见表 3。

4 讨论

糖尿病作为一种复杂的代谢性疾病,常常会导致多系统、多脏器损害^[10-12]。杂栽在诱导的大鼠糖尿病模型是目前公认的经典动物模型，此模型能够诱导出与人类2 型糖尿病有许多共同特征的大鼠糖尿病模型，该模型选取的SD 大鼠来源丰富,易于饲养，实验成本低,其视网膜血管与人类相似，可用于糖尿病视网膜病变的相关研究^[13-17]。本研究以经典药方葛根芩连汤为研究对象，采取STZ 模型，观察了葛根芩连汤对糖尿病大鼠视网膜病变的良好治疗效果^[18-20]。

糖尿病视网膜病变的病因较为复杂，目前为止尚缺乏有效的治疗方法^[21-22]。传统中医药治疗糖尿病视网膜病历史悠久，不良反应小，温和持久，且能很好的缓解并发症的发生^[23-24]。有研究报道称葛根芩连汤有降低血糖及抗胰岛素抵抗作用，方中黄芩具有清肺胃实热、解血中糖毒作用，黄连具有清热燥湿、泄火解毒、治消渴病的功效，葛根中含有的黄酮类、生物碱类等化合物等具有调节糖代谢、调节脂代谢、改善胰岛素抵抗、改善氧化应激等疗效，甘草次酸、甘草黄酮抗氧化剂对胰岛茁细胞具有较好的保护作用^[25]。

另有研究发现^[26-27]，葛根芩连汤能显著降低2 型糖尿病动物的TG、TC、低密度脂蛋白等的水平。在潘竞锵的研究中，探讨了葛根芩连汤降低动物血糖的作用机制，研究结果证明了葛根芩连汤具有磺脲类药物和双胍类药物的降糖作用^[28]。宋艳敏等^[29]的研究证明了葛根素具有够保护糖尿病大鼠视网膜的作用。

本研究通过葛根芩连汤干预STZ 模型视网膜病变，结果显示，与DM 组和DM+NS 组比较，实验组大鼠空腹血糖明显降低。与DM 组和DM+NS 组比较，实验组大鼠血胰岛素含量增加。与DM 组和DM+NS 组比较，实验组大鼠TG 明显降低而HDLC明显升高。这些结果均证明葛根芩连汤可对糖尿病大鼠视网膜病变发挥较好疗效。通过Westemblot检测得知与DM组和DM+NS 组比较，实验组大鼠PKB 的表达明显增加、ICAM-1 的表达明显下降，与DM 组和DM+NS 组比较，实验组中凋亡相关蛋白C-myc 明显减少，因此推测葛根芩连汤可通过抑制炎症因子以及凋亡相关蛋白C-myc 的表达从而抑制糖尿病大鼠视网膜病变的发展。光镜下观察到实验组视网膜超微结构病变明显减轻，提示使用此方能减轻视网膜超微结构的损害，延缓糖尿病视网膜病变的进程。

总之，葛根芩连汤能对大鼠糖尿病视网膜病变从多向性、多层面的发挥治疗作用，其所具有的优势是不可比拟的。相信随着对中药复方研究的深入,葛根芩连汤将会以其良好的临床疗效，逐步被广泛推广应用。但本研究仅做了初步的探索，还需要进一步的探讨研究来加以完善。