糖尿病肾病（DN）是临床上常见而严重的慢性微血管并发症之一，临床特征为蛋白尿漏出，肾功能进行性恶化，病理变化为肾小球滤过率改变，基底膜增厚，系膜细胞增宽，直至肾小球硬化，发展至肾功能衰竭。其发病率随着糖尿病患者数的增加，愈来愈高，严重威胁着人类的健康。DN的发病机制复杂而多，近几年来，很多研究表明，各种原因导致在肾小球滤过膜的足细胞损伤参与了糖尿病肾病产生发展中起很大的作用，因此对足细胞的研究进而改善足细胞功能的药物成为治疗糖尿病肾病的关注点。

导师南征教授认为“毒损肾络，邪伏膜原”理论是糖尿病肾病的主要病因病机，提出了“解毒通络，益肾导邪，疏利膜原”治疗思路与方法。榛花消肾安胶囊是南征教授常用的治疗糖尿病肾病的经验方，在临床上疗效显著。通过本实验观察实验性糖尿病大鼠的肾脏及足细胞相关蛋白α-actinin-4 的表达影响，表明“榛花消肾安胶囊”治疗糖尿病肾病的有效性。

1 材料与方法 1.1 实验方法

将70 只Wistar 雄性大鼠按照随机数字表法分为正常对照组和模型组，适应性喂养1周。造模1 d前晚上8点到早上8点予将要造模的60 只大鼠禁食而不禁水12 h。分批单次腹腔注射1%链脲佐菌素（STZ）（50 mg/kg），STZ 溶解之后20 分钟内用完。同时，正常对照组大鼠则腹腔注射等体柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。注射STZ 72 h后，尾静脉采血，测空腹血糖逸16.7 mmol/L 则为造模成功，列入观察对象。实验动物分组及给药方法为将造模成功的大鼠随机分为糖尿病（DM）模型组，中药高、中、低剂量组（予榛花消肾安胶囊干预治疗），阳性对照组（予厄贝沙坦片干预治疗）。中药组予榛花消肾安胶囊混悬液灌胃，高、中、低剂量组分别以1,0.5,0.25 g/（kg·d）（相当于成人临床用药量的5、10、20倍）；阳性对照组予厄贝沙坦混悬液20 mg/（kg·d）灌胃；正常对照组及DM模型组予等体积蒸馏水灌胃。连续灌胃观察12周，每4周测尿微量白蛋白1次。

1.2 标本采集 1.2.1 血尿生化指标测定

每4 周用代谢笼收集尿量1 次，计量，用离心机3 000 r/min 离心10 min，分层后取上清液装入EP 管中，-80℃冰箱中冻存，待检测尿微量白蛋白；每2 周大鼠尾静脉采血，监测血糖；予40 mg/kg 戊巴比妥钠腹腔注射，腹主动脉取血，离心（3 000 r/min，10 min），分层后取血清分装入EP 管中，-20℃冰箱中保存，待测血糖、血脂、肾功能。

1.2.2 免疫组化

迅速取出双肾，放置于生理盐水中冲洗，去掉肾包膜，滤纸吸干，左肾称质量，并切取一半置于10%中性福尔马林液中固定，待石蜡包埋，切片，进行苏木精-×红（HE）染色及免疫组化。

1.2.3 电镜

右肾切取小块肾皮质，放置于2.5%戊二醛/0.1 mol/L 二甲胂酸钠缓冲液（pH7.4）中固定，用于电镜观察。

1.2.4 实时定量聚合酶链反应（PCR）

取1 μL提取的RNA，用NAnoDROP 2000进行提取RNA含量与纯度测定。提取组织的RNA 为模板，用All-in-OneTM First-Strand cDNA Synthesis Kit 合成cDNA 第一链。已合成的cDNA 第一链为模板，进行相关基因表达的实时定量PCR，根据PCR结果评价各个基因在不同分组内的表达。检测基因引物设计与合成根据检测基因序列，用PRIME blast 工具进行引物网上设计，引物由北京欣博盛生物技术有限公司合成，每个引物为2OD，纯化级别为PAGE 级。应用染料法，进行基因表达的实时定量PCR 检测。采用的试剂盒为广州复能基因公司的All-in-OneTM qPCRMix 试剂盒。α-actinin-4 的No. of Genbank 为nm-031675.2，引物序列为上游：GGCTGAGAAGGGCTATGAAGAA，下游：AGAGCTTTGATGTCTGACAGGG，PCR产物长度为180bp。

1.3 统计学处理

实验结果采用SPSS 18.0 软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析和重复测量方差分析，数据用均数±标准差（x±s）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 肾质量/体质量、24 h尿量、空腹血糖比较

实验结束时，中药各剂量组与西药对照组大鼠肾质量/体质量明显高于DM模型组（P<0.01）。中药各剂量组及西药对照组尿量较DM 模型组明显减少（P<0.01）；中药高剂量组较西药对照组明显减少尿量（P<0.01）。DM模型组、中药各剂量组、西药对照组大鼠血糖明显高于正常对照组（P<0.01）；中药各剂量组与西药对照组大鼠血糖明显低于DM 模型组（P<0.01）；中药高、中剂量组空腹血糖明显低于西药对照组（P<0.01）。见表 1。

2.2 肾功能

实验结束时，DM 模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）水平均高于正常对照组（P<0.01）；中药各剂量组及西药对照组大鼠BUN、Scr 水平均低于DM模型组（P<0.01）。见表 2。

2.3 24 h尿微量白蛋白动态变化比较

实验期间，第4、8、12 周，DM 模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠24 h尿微量白蛋白（ALB）含量逐渐增加（P<0.01）；中药各剂量组和西药对照组从第4 周开始ALB 含量较DM模型组降低（P<0.01）。见表 3。

2.4 病理组织学改变

1）光镜观察：正常对照组大鼠肾小球无明显异常，系膜细胞（MC）无增生，肾小球系膜区细胞外基质（ECM）无明显增多，绝大部分毛细血管袢开放，间质无明显炎细胞浸润，无纤维组织增生，肾小球囊无渗出、无粘连，近端小管结构正常；DM模型组大鼠肾小球系膜区弥漫性增宽，肾小球基底膜（GBM）增厚，MC轻度增生，肾小球ECM增多，部分毛细血管受压而塌陷，间质纤维组织增生，肾间质中炎性细胞浸润，肾小球囊粘连；中药各剂量组、西药对照组肾小球结构也有类似病理改变，但较DM 模型组明显减轻，大鼠肾小球ECM 增多、MC 增生较DM 模型组明显减轻，大部分毛细血管腔处于开放状态，间质纤维组织增生较DM 模型组减少。2）电镜观察：正常对照组大鼠肾小球滤过膜结构完整，毛细血管内皮细胞正常，GBM 薄厚均匀，足细胞结构完整，足突排列整齐、清晰、分布均匀，系膜区未见扩大，系膜基质无明显增多；DM 模型组大鼠肾小球滤过膜明显改变，GBM 弥漫性增厚，内皮细胞广泛融合、增生，足细胞足突广泛融合，足细胞数目减少，系膜区扩大，基质明显增多；中药各剂量组与西药对照组病理改变不同程度减轻，大鼠肾小球毛细血管内皮细胞正常，GBM 未见增厚，足突部分融合，系膜区未见明显扩大。

2.5 α-actinin-4 蛋白表达

正常对照组的α-ac原tinin-4 蛋白沿着肾小球基底膜毛细血管样点线状分布均匀（图 1A）；DM 模型组的α-actinin-4 蛋白表达明显高于正常对照组（图 1B）；中药高、中、低剂量组和西药对照组的α-actinin-4 蛋白表达较DM模型组减弱（图 1C~F）。DM 模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠α-actinin-4 灰度值均高于正常对照组（P<0.01）；中药高、中、低剂量组和西药对照组大鼠灰度值均低于DM模型组（P<0.01）。见表 4。2援6 α-actinin-4mRNA的表达DM模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠的α-actinin-4mRNA 含量均明显高于正常对照组（P<0.01）；中药高、中、低剂量组和西药对照组α-actinin-4 m RNA含量均低于DM模型组（P<0.01）。见表 5。

3 讨论

近几年来，中国DM 患者人数与日俱增，约占全球DM患者人数的三分之一，已经成为DM患病率较高的国家之一，2 型DN 的发生率约33%-48%^[1]。DN 是糖尿病的常见而慢性微血管并发症，导致慢性肾功能衰竭的主要原因,亦是DM患者的主要死亡原因。

毒损肾络”是导师南征教授提出的消渴肾病的病机关键之一。毒是指一切对机体的生理功能产生不良影响的致病因素。毒邪分为内毒和外毒，外毒是指外邪直接侵入机体，而致机体受损的一类物质；内毒是指由脏腑功能失常和气血运行失调，使体内的病理产物不能及时排出，积久造成气滞、血瘀、痰凝、湿浊、水停等病理产物，邪盛而成热毒、瘀毒、痰毒、湿毒、浊毒、燥毒等毒邪。毒邪多在疾病过程中产生，又是继续损害机体的因素，会形成恶性循环。因消渴病迁延日久，则散膏损伤，三焦气化受阻，脂膏堆积，痰湿、湿热、瘀滞相结成毒邪，其毒邪伏于膜原，毒损肾络，肾体用皆损，肾间动气大伤，气血逆乱，而成消渴肾病^[2]。依秋霞等^[3]认为，因消渴日久，脂毒内生，阻于肾络气机运行，阻碍津血运行，凝聚而成膏脂，亦可成痰瘀，致病的膏脂与新产生的膏脂和痰瘀胶着黏滞，再生新的毒邪，而损伤肾络，循环往复，终致消渴肾病。毒损肾络与消渴肾病密切相关，脂毒在病情过程中起关键的作用。“邪伏膜原”是导师南征教授近期提出的理论，是根据消渴肾病的缠绵难愈特点，又深入研究膜原的范围和作用而提出。从后世许多医家对膜原的描述上来认为，膜原是一种膜样组织，包括脏腑间联系膜，肌肉筋骨间膜、胸膜、腹膜等组织以及现代医学中肾小球滤过膜等微观结构，其分布广泛，具有联系机体表层与内深层各个组织，沟通气血，输布津液，起着桥梁与纽带作用。南征^[4]认为，治疗消渴肾病的治则为扶正祛邪，攻补兼施。治以解毒通络益肾、调散膏、达膜原。榛花消肾安胶囊是南征教授常用的治疗糖尿病肾病的经验方，在临床上疗效显著。组成为榛花、土茯苓、黄芪、覆盆子、穿山甲、血竭、金荞麦、益母草、草果、槟榔、厚朴，具有解毒通络，益肾导邪疏利膜原之功。α-actinin-4是肌动蛋白交连蛋白，维持细胞结构起重要作用，能交联肌动蛋白微丝，将肌动蛋白交联成可收缩的纤维束^[5]。主要表达于足细胞，其基因突变可引起足突融合、消失，致使蛋白尿的产生。高糖和糖基化终末产物（粤郧耘泽）均可使α-actinin-4表达的减少，可致DN肾小球足细胞骨架的破坏^[6]。Dandapani等^[7]研究发现，不够α-actinin-4鼠的肾小球足细胞数量与尿中足细胞的含量均减少。在高糖与晚期糖基化产物联合下，足细胞α-actinin-4 的表达减少。杨晓等^[8]观察研究造模DM大鼠的α-actinin-4 表达水平，随着病情进展，α-actinin-4 水平逐渐减少，可参与DM 大鼠蛋白尿的产生，可能与糖基化终末产物（AGEs）的含量增多有关。段玉红等^[9]研究发现，糖尿病时持续高血糖，脂代谢紊乱特异性损害Nephrin、α-actinin-4 的表达，并造成足细胞损伤，是足细胞数目减少，出现尿蛋白。

本实验表明，榛花消肾安胶囊能够改善实验性DM 大鼠的一般状态，降血糖、血肌酐和尿素氮；改善实验性DM 大鼠肾脏组织的病理结构，减轻肾小球基底膜增厚，细胞外基质的积聚，系膜增生，改善足细胞形态，从而减轻DM 性肾小球硬化；能够抑制实验性DM 大鼠早期肾脏肥大，减少ALB 的排出，改善肾功能，而且能够抑制实验性DM 大鼠肾组织α-actinin-4蛋白及mRNA的表达。