咳嗽变异性哮喘（CVA）是以反复发作的慢性咳嗽为特征的一种特殊类型哮喘，儿童患病率为0.77％~5.0％^[1]。由于CVA的临床表现不典型，缺乏特异性，常被忽视或误诊，可能会给予抗生素长期治疗而疗效不佳^[2]。有研究发现其复发率较高达30%，可能与患者经常接触过敏原有关^[3]。CVA发病迅速、阵发性、易反复发作等特点与风邪为“百病之长，善行数变”、“其性轻扬，风盛则挛急”的特点相似。外风责之于肺，内风责之于肝，肝郁肺虚，木火刑金，肝肺同病则发为咳嗽。中医药在防治儿童CVA方面具有独到优势，可以弥补西医治疗的不足^[4]，本研究通过观察自拟肝肺同治祛风方对CVA模型大鼠气道慢性炎症的作用，观察其改善气道慢性变态反应性炎症的效应，探讨从风论治CVA作用机制。

1 材料与仪器 1.1 动物

4周龄雄性SPF级SD大鼠72只，体质量（100±10）ｇ，辽宁长生生物技术有限公司(许可证编号：[动]SCXＫ（辽）2010-0001）。

1.2 试剂

卵蛋白（ｏvalbumin OVＡ）：Sigma公司，GradeII；氢氧化铝的生理盐水溶液沈阳市试剂三厂（批号：080714）；辣椒素溶液：上海紫一试剂公司（批号：20110514）；IgE酶联免疫试剂盒：（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 药物

普米克令舒（吸入用布地奈德）：葛兰素史克制药（重庆）有限公司，国药准字H20010389，购于辽宁中医药大学附属医院西药局。清肺祛风方（黄芩、荆芥、蝉蜕、防风、甘草），清肝熄风方（地龙、钩藤、白芍、五味子、甘草），肝肺同治方（黄芩、荆芥、蝉蜕、防风、地龙、白僵蚕、钩藤、白芍、五味子、麦门冬、甘草）诸药材，购于辽宁中医药大学附属医院中草药局，经药师鉴定为道地药材。常规水煎煮，浓缩为每毫升1 g生药溶液，备用。

1.4 仪器

透明雾化吸入箱，自制；INQUA NEBplus型压缩雾化吸入机，INQUA GmbH公司，德国；精密转轮切片机（LEICA RM2135）；系统生物显微镜（OLYPUS BX50F4）。

2 方法 2.1 造模与分组

采用随机数字表法将72只大鼠分为正常对照组、模型对照组、激素吸入组、清肺祛风组、清肝熄风组、肝肺同治组，每组均12只。清洁动物房内室温下常规饲养7 d，自由食水，记录各组大鼠体质量、呼吸、进食水量、肛温情况。

造模方法：卵蛋白氢氧化铝致敏激发CVA大鼠，烟熏方法复制肺气虚大鼠模型^[5]，长期激怒法建立肝气郁结、肝火犯肺动物模型^[6-7]，采用复合因素建立CVA肝郁肺虚病证结合动物模型^[8]。

2.2 给药

造模第16日，第1次卵蛋白生理盐水溶液雾化激发次日开始给药，雾化攻击前30 min灌胃给药，非雾化日常规给药，连续给药15 d。中药治疗组每日灌胃等效剂量中药复方^[9]，每日每千克体质量12 g生药量，每日1次，共15 d。正常对照组、模型对照组及激素治疗组灌胃等量生理盐水。激素治疗组大鼠放入透明雾化箱中，喷入普米克令舒生理盐水溶液，吸入量为0.6 mL/kg体质量，浓度为20%，每日1次，共15 d。

2.3 标本处理

造模第30天，辣椒素激发引咳试验后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，打开胸腔，心脏穿刺取血，置于普通试管，静置30 min，取上层血清，-80 ℃保存备用。结扎右主支气管，分离右肺上、中、下叶，右肺中叶置于新鲜配制的中性4%多聚甲醛固定液中。

支气管肺泡灌洗液（BALF）回收：以眼科剪在气管上剪一斜口，插管，把针头和气管一起固定结扎，左肺肺泡灌洗，分别取0.8、0.8、0.5 mL，0.01 mol/L PBS依次灌洗3次，灌洗液回收率>90%。BALF于1 500 r/min离心10 min，细胞沉淀用1 mL PBS重悬，取约30 μL细胞悬液，甩片晾干，95%的乙醇固定，常规HE染色，光镜下进行细胞分类计数。计数200个细胞，得出嗜酸性粒细胞数量。

2.4 观测指标

大鼠一般状态观察、肺支气管病理组织形态学观察、BALF嗜酸性粒细胞计数、ELISA法检测血清IgE含量。

2.5 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行录入及分析，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，以P < 0.05认为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 大鼠一般状态观察

造模前各组大鼠体质量、呼吸、进食水量、肛温等情况基本一致，无统计学差异。正常对照组大鼠体质量稳定增长，呼吸平稳，行动灵活，反应灵敏，毛色光泽。模型组体质量增长明显减慢，各治疗组体质量较模型组增长明显，但仍低于正常对照组。模型组及各治疗组雾化激发后出现烦躁不安、拱背蜷缩，皮毛黄湿无光泽，时有脱落，消瘦，呼吸急促、咳嗽喘息等症状。

3.2 大鼠肺、支气管形态学检测

正常对照组肺内各级支气管结构正常，支气管壁及其周围组织结构清晰，支气管管壁和平滑肌厚度正常，支气管上皮细胞完整，管腔内无脱落细胞，间质内无炎症细胞浸润。肺泡上皮完整，肺泡壁毛细血管无充血、缺血，肺泡腔内清洁无渗出，可见少量嗜酸性粒细胞。模型对照组支气管管腔狭窄，黏膜增厚，支气管上皮纤毛倒伏、缺失，上皮细胞脱落。肺泡腔增大，肺泡间隔及气道平滑肌明显增厚，细支气管管腔扩大，黏液分泌增多，可见大量嗜酸性粒细胞浸润。与模型组比较，各治疗组支气管组织病理变化明显减轻，激素治疗组、肝肺同治组织病理改善更明显。见图 1。

3.3 BALF细胞计数

与正常对照组比较，模型对照组BALF涂片EOS计数显著升高（P < 0.01）；与模型对照组相比，各治疗组EOS计数明显降低，有统计学差异（P < 0.01），其中以激素治疗组、肝肺同治组降低最明显。见表 1。

3.4 ELISA法检测大鼠血清中IgE含量

与正常对照组比较，模型对照组IgE含量显著升高（P < 0.01）；与模型对照组相比，各治疗组IgE的含量明显降低，有统计学差异（P < 0.01），其中以激素治疗组、肝肺同治组降低最明显。见表 2。

4 讨论

CVA传统中医病因病机为为宿痰伏肺、复感外邪，遇外感引触^[10]，《景岳全书》^[11]指出：“喘有夙根，遇寒即发，或遇劳即发者，亦名哮喘。”《普济本事方》^[12]中述“此症有苦至终身者，亦有母子相传者”。CVA表现为反复发作的刺激性干咳，具有阵发性、痉挛性的特点，常伴有鼻塞、流涕、鼻痒等症状^[13]，与中医“风”发病迅速、“善行而数变”、“风盛则痒”的致病特点相符，提示风邪是本病发生、发展和演变过程中主要致病因素^[14]。小儿为稚阴稚阳之体，素体肺虚易感外风，CVA病初患儿见鼻塞、咽痒、流涕、鼻痒，为外风袭肺；内风者，乃肝木化风所致，小儿素体肺常不足、肝常有余，既有金行的虚弱不足，又有木行的过于亢盛，则肺金易被肝木反克。素体阴虚，水不涵木，阴虚风动而内风上扰，木叩金鸣而咳。CVA患儿先天禀赋不足，具有特应性体质，易生风化痰。《读医随笔》^[15]曰“凡病之气结……哮喘，皆肝气不能舒畅所致也。”李彦君等^[16]也认为，一旦感受风寒之邪气，外风引动内在的伏风，内外之邪相合，导致肺失宣降，发生CVA。所以，CVA患儿常由于治不得法而外邪不解，邪郁于肺，引动内风，风动上扰，内外风相合则金钟动摇，宣肃失司，发为咳嗽^[17]。

本研究以卵蛋白氢氧化铝致敏激发CVA大鼠，模型大鼠出现呼吸急促、烦躁、咳嗽、前肢缩抬、腹肌收缩、可闻及哮鸣音等呼吸道痉挛症状，符合CVA临床特点^[18]。以中医五行生克制化理论为依据，模拟中医传统病因，选择幼龄大鼠，取其幼龄肺常不足，烟熏致肺气益虚，易感外风；幼鼠素体阴常不足、阴液亏虚，长期激怒使肝气郁结，肝木化风，木火刑金，肺虚肝旺。模型大鼠烟熏过程中，逐渐出现精神萎靡、食量减少、体质量增长缓慢、间断咳嗽，提示肺虚；大鼠烦躁不安，抓咬模具，易激惹，自发活动增多提示肝气郁结，肝阳上亢；呼吸急促，无刺激状态下咳嗽次数较正常组增多提示肝气犯肺，肝阳化风。

在辨证论治的基础上，依据方剂的功效或其组成药物的功效推测或反证其对应证候的属性^[19-20]，即为以方测证。本CVA肝肺通病证候病位在肺，病本在肝，应重在肝肺同治，故用自拟肝肺同治方。以黄芩、荆芥、蝉衣、防风清肺止咳化痰；地龙、僵蚕、钩藤清肝泻火、止咳平喘，白芍、五味子、麦冬、甘草养阴柔肝。内外合治，使肝火不刑肺金，则肺宣肃复常，咳嗽自止。研究结果显示，肝肺同治祛风法可以减轻大鼠气道嗜酸性粒细胞浸润、大鼠气道病理组织变化及降低血清IgE水平。尤其在改善肝火犯肺的中医证候方面，明显优于激素治疗组，提示中医辨证治疗即可以有效改善患儿气道慢性炎症反应，同时可能改善CVA患儿烦躁、多动等的中医证候，提高患儿生存质量。