2016, Vol. 33文章信息
- 苏晓华 , 宋殿荣 , 张崴 , 郭洁 , 王雅楠
- SU Xiao-hua , SONG Dian-rong , ZHANG Wei , GUO Jie , WANG Ya-nan
- 妇痛宁对子宫内膜异位症COX2-PGE2作用途径的影响
- Effect on the COX2-PGE2 pathways of endometriosis by Fu Tong Ning
- 天津中医药, 2016, 33(8): 481-486
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2016, 33(8): 481-486
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2016.08.10
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文章历史
- 收稿日期: 2016-03-24
2. 天津中医药大学第二附属医院妇科, 天津 300150
子宫内膜异位症（EMs）是一种妇科常见疾病，是以有功能的子宫内膜组织或细胞出现在子宫腔以外为特点的慢性疾病[1]。EMs在育龄期妇女中发病率约为7%~10%[2]，可出现慢性盆腔痛、性交疼痛、痛经和不孕等症状，可引起女性精神心理障碍和降低社会功能[3]，严重地影响了女性的健康和生活质量。EMs患者的不孕率为非EMs患者人群的20倍[4]，对其治疗也有一定的经济负担，美国每年需花费220亿美元[5]、加拿大花费18亿加币[6]来治疗该病。目前EMs的治疗主要包括药物治疗和手术治疗，药物治疗主要是通过降低体内激素水平而抑制异位病灶的生长，使之萎缩，该治疗可引起月经不调、阴道干涩、潮热、体质量增加、骨质疏松等不良反应，且用药期间不适合妊娠[7]，从而限制了药物的长期应用。手术治疗后易于复发，2 a内复发率约为21.5%，5 a内复发率约为40%~50%[8]，因此寻求新的治疗方法降低复发和减轻不良反应是亟待解决的问题。
EMs在中医学属于“痛经”、“癥瘕”的范畴，《景岳全书·妇人规》指出“瘀血留滞作癥，惟妇人有之，其证则由经期或产后，内伤生冷或外受风寒；或恚怒伤肝，气逆血留；或忧思伤脾，气虚而血滞；或积劳积弱，气弱不行，总由血动之时，余血未净，而一有所逆则留滞，日积而渐成癥矣”。1990年中国中西医结合学会妇产科专业委员会第三届学术会议上正式将EMs确定为血瘀证，并得到大家的公认。本院著名妇科专家韩冰教授在中医理论指导下，结合多年治疗EMs的临床经验以及对国内外研究进展，确立了“活血化瘀，软坚散结”为治疗大法，拟定代表方剂妇痛宁，临床应用治疗EMs患者效果显著。本课题通过COX2作用途径研究化瘀散结中药妇痛宁对EMs血管生成、侵袭和转移方面的影响。
1 材料与方法 1.1 标本采集异位子宫内膜组织取自2012年10月—2013年12月在天津中医药大学第二附属医院妇科因卵巢巧克力囊肿行手术剥除的异位病灶，术后病理证实符合EMs，患者年龄23~49岁（平均32岁），术前6个月内未服用抗炎、激素类等药物治疗。共收集异位子宫内膜组织30例。所有标本的采集均得到患者本人或家属知情授权，并经医院伦理委员会批准。
取材后将标本迅速放入装有冰全培基（含有1%双抗、10%胎牛血清、89%DMEM/F12）的离心管中，30 min内移入实验室于紫外线消毒后的超净台中进行操作。
1.2 子宫内膜细胞原代培养参考文献[9]的方法消化培养子宫内膜细胞。
1.3 子宫内膜细胞传代培养原代细胞长满瓶壁约80%时进行传代，以1:2或1:3比例传代。将第二代子宫内膜细胞冻存到液氮中备用。
1.4 子宫内膜细胞复苏从液氮中取出冻存管，迅速放入37 ℃温水浴中，轻轻摇晃令其快速解冻，离心后加入含10%胎牛血清的全细胞培养液重悬细胞，接种到75 cm2培养瓶中培养。
1.5 实验动物选用鼠龄为5周的健康SPF级雌性BALB/c裸鼠40只，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号为：SCXK-2012-0004。裸鼠适应环境一周后，按随机数字表法随机分为空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组，每组8只，各组之间体质量没有统计学差异。
1.6 造模方法在无菌条件下进行操作：将培养的异位子宫内膜细胞，配制成25×106/mL的浓度，注射至各组裸鼠腹部皮下的4个部位，即左上象限、左下象限、右上象限和右下象限，每组8只裸鼠，共注射32个部位。
1.7 实验药物及给药方法妇痛宁、孕三烯酮均由天津中医药大学第二附属医院提供。参照《人和动物间按体表面积折算的等效剂量比率表》，裸鼠用妇痛宁剂量每次约为0.003 9 g/g，2次/日，该剂量为中剂量，低剂量=1/2×中剂量，高剂量=2×中剂量。裸鼠用孕三烯酮剂量每次约为0.001 95 mg/g，每周2次。
注射细胞10 d后，空白对照组每日灌服无菌水，每次0.5 mL，2次/日。低剂量、中剂量和高剂量治疗组裸鼠每日灌服不同剂量妇痛宁中药，每次0.5 mL，2次/日。阳性对照组裸鼠灌服孕三烯酮，每次0.5 mL，2次/周，其余时间灌服等量生理盐水。
1.8 观察指标 1.8.1 裸鼠一般状态治疗期间观察裸鼠的进食、活动、二便等一般情况。
1.8.2 病灶大小游标卡尺每日测量裸鼠腹部皮下病灶大小，并记录。药物治疗3周后处死裸鼠，各组病灶分别固定在4%福尔马林溶液、RNA储存液和磷酸盐缓冲液（PBS）中保存备用。
1.8.3 免疫组化法测定病灶VEGF表达及CD34标记的微血管密度（MVD）参考文献[10]的分析方法，测定病灶中VEGF表达和CD34标记的微血管，见图 1、图 2。
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| 图 1 VEGF染色强度 Fig. 1 The staining intensity of VEGF |
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| 图 2 CD34标记的微血管 Fig. 2 The microvessels marked by CD34 |
严格按试剂盒说明操作。
1.8.4.2 引物序列见表 1。
| 基因名称 | 引物序列(5鸳寅3鸳） | 片段大小 | 退火温度(益） |
| COX2 | Forward: CTCAGATATTAACTGGTTGTAGGC Reverse: TCCTTTGAATGGAAAGTGAC^ | 166 | 56 |
| PGE2 | Forward：GCAGCTGACCCTGTACCAGTACAAGACG Reverse：TTGAGTCGCTTGCTGATGAGGTACATGG | 582 | 53 |
| VEGF | Forward：GTGCAAGGCCAGGGCATGGG Reverse ：GTCCTGAAGCTCCCCAAACTCC | 167 | 53 |
| Snail | Forward：AAGGCACTTGGAAGGGGTAT Reverse: ATGGGAATAAGTGCAAAAGAGG | 106 | 54 |
| E-cadherin | Forward：CGGGAATGCAGTTGAGGATC Reverse: GGATGGTGTAAGCGATGGC | 200 | 55 |
| β-actin | Forward: GATGAGATTGGCATGGCTTT Reverse: CACCTTCACCGTTCCAGTTT | 100 | 55 |
严格按试剂盒说明操作。取各组PCR产物7 μL加入样本孔中行1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳条带，每个样本经PCR扩增后以Marker作为参照。
1.8.4.4 PCR产物半定量分析PCR产物电泳后经Gel-PRO ANALYZER凝胶定量分析软件对电泳条带进行灰度分析，目的基因相对表达强度=目的基因电泳条带灰度值/β-actin内参照条带灰度值。
1.8.5 Western-blot法检测各组病灶中Snail、E-cadherin蛋白表达检测蛋白样品制备，SDS-PACE电泳分离蛋白，转膜，免疫反应及化学发光、显影、定影均严格参照试剂盒，按实验步骤操作。
1.9 统计学方法采用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计处理，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法；等级资料的比较采用Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较采用Nemenyi检验，P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2 实验结果 2.1 裸鼠一般状态实验中裸鼠一般状态好，饮食、二便正常，体质量正常增长，无裸鼠死亡。
2.2 病灶体积比较妇痛宁治疗低剂量组裸鼠病灶体积与空白对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）；中剂量组和高剂量组裸鼠病灶体积均变小，与空白对照组比较差异有统计学意义（P < 0.05）；但中剂量组和高剂量组病灶体积均大于阳性对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 2。
| 组别 | 动物数 | 病灶数 | 体积(mm3) |
| 空白对照组 | 8 | 32 | 12.536±0.413 |
| 低剂量组 | 8 | 32 | 12.241±0.356## |
| 中剂量组 | 8 | 32 | 11.685±0.491**## |
| 高剂量组 | 8 | 32 | 11.379±0.377**# |
| 阳性对照组 | 8 | 32 | 10.858±0.327 |
| 注：与空白对照组比较，**P < 0.01；与阳性对照组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。 | |||
低剂量组病灶中VEGF表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）；中剂量组和高剂量组病灶中VEGF表达与空白对照组比较均降低，差异有统计学意义（P < 0.05），与阳性对照组比较VEGF表达均升高，差异有统计学意义（P < 0.05），见表 3。
| 组别 | 病灶数 | VEGF表达 | ||
| 低表达 | 中表达 | 高表达 | ||
| 空白对照组 | 32 | 3 | 7 | 22 |
| 低剂量组 | 32 | 3 | 9 | 20 |
| 中剂量组 | 32 | 9 | 18 | 5 |
| 高剂量组 | 32 | 13 | 15 | 4 |
| 阳性对照组 | 32 | 23 | 6 | 3 |
低剂量组MVD与空白对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）；中剂量组和高剂量组MVD与空白对照组比较均减少，差异有统计学意义（P < 0.05），但与阳性对照组比较MVD均升高，差异有统计学意义（P < 0.05），见表 4。
| 组别 | 病灶数 | MVD |
| 空白对照组 | 32 | 355.46±30.45 |
| 低剂量组 | 32 | 3336.44±44.51## |
| 中剂量组 | 32 | 303.52±23.70*## |
| 高剂量组 | 32 | 267.96±20.95**# |
| 阳性对照组 | 32 | 229.36±15.26 |
| 注：与空白对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与阳性对照组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。 | ||
妇痛宁治疗后低剂量组裸鼠异位病灶COX2、PGE2、VEGF、Snail、E-cadherin mRNA表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。而中、高剂量组COX2、PGE2、VEGF、Snail mRNA表达比空白对照组降低，E-cadherin mRNA表达比空白对照组升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。但各治疗组COX2、PGE2、VEGF、Snail mRNA表达均比阳性对照组升高，E-cadherin mRNA表达比阳性对照组降低，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 3、表 5。
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| 图 3 各组子宫内膜异位病灶目的基因扩增产物电泳图 Fig. 3 Electrophorogram of target gene amplification products of EMS lesions in each group 0：空白水；M：DNA Marker；1：空白对照组；2：低剂量组；3：中剂量组；4：高剂量组；5：阳性对照组；↓代表电泳方向 |
| 组别 | 动物数 | COX2 | PGE2 | VEGF | Snail | E-cadherin |
| 空白对照组 | 8 | 0.965±0.029 | 0.993±0.029 | 0.810±0.012 | 0.590±0.032 | 0.637±0.021 |
| 低剂量组 | 8 | 0.910±0.044## | 0.958±0.015## | 0.769±0.039## | 0.516±0.059## | 0.704±0.022## |
| 中剂量组 | 8 | 0.804±0.015**## | 0.900±0.021**## | 0.548±0.041**## | 0.410±0.046**## | 0.763±0.068**## |
| 高剂量组 | 8 | 0.691±0.027**# | 0.823±0.035**## | 0.469±0.015**# | 0.348±0.021**# | 0.861±0.016**## |
| 阳性对照组 | 8 | 0.611±0.041 | 0.701±0.033 | 0.397±0.038 | 0.262±0.029 | 0.988±0.025 |
| 注：与空白对照组比较，**P < 0.01，与阳性对照组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。 | ||||||
妇痛宁治疗后低剂量组裸鼠异位病灶Snail、E-cadherin蛋白表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。中、高剂量组病灶中Snail蛋白表达比空白对照组降低，E-cadherin蛋白表达比空白对照组升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。但各治疗组Snail蛋白表达比阳性对照组升高，E-cadherin蛋白表达比阳性对照组比较低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 4、表 6。
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| 图 4 各组子宫内膜异位病灶目的蛋白的表达 Fig. 4 The expression of target protein of EMS lesions in each group 1：空白对照组；2：低剂量组；3：中剂量组；4：高剂量组；5：阳性对照组 |
| 组别 | 动物数 | Snail | E-cadherin |
| 空白对照组 | 8 | 0.839±0.109 | 0.457±0.038 |
| 低剂量组 | 8 | 0.790±0.082## | 0.546±0.040## |
| 中剂量组 | 8 | 0.694±0.033*## | 0.699±0.078*## |
| 高剂量组 | 8 | 0.620±0.020**# | 0.972±0.135**# |
| 阳性对照组 | 8 | 0.515±0.034 | 1.217±0.193 |
| 注：与空白对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，与阳性对照组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。 | |||
瘀血内停是EMs发病的病理基础，故治疗当以化瘀散结为主。妇痛宁由丹参、三棱、鳖甲、海藻、薏苡仁、皂角刺组成。方中丹参，性苦、微寒，归心、肝经，能活血化瘀、凉血、养血、止痛，为君药。三棱性苦、平，莪术辛、苦、温，辛以行气血，苦以通泄、燥湿，二者均归肝、脾经，有破血行气，消积止痛之功能，共为臣药。鳖甲、海藻均为咸寒之品，入肝经，能活血通经。鳖甲为血肉有形之品，用之“以动制动、以肉治肉”，以其剔邪搜络、攻坚破积之性，直达病所，畅通络脉气血。海藻消痰软坚散结利水，促使停聚之水湿消散，津液尽化雾露；薏苡仁甘、淡、微寒，入脾、胃、肺，功能利水渗湿，健脾以除积湿，调整机体水液代谢平衡，三者共为佐药。皂角刺性辛、温，能祛痰通窍，消积破癥，活血散结，其性锐利，易直达病所，为使药。全方共奏活血化瘀、软坚散结之功效。
EMs之发病多因经期、产时、产后（特别是小产或人工流产后）摄生不慎，外有所感，内有所伤，或手术所伤，使离经之血当行不行，当泻不泻，留滞体内，成为瘀血。瘀血久停，渐成癥瘕积聚。EMs虽为良性疾病，却具有无限生长、生成新生血管、浸润并破坏周围组织和局部或远处转移等恶性肿瘤的一些特性。在EMs病灶形成过程中，黏附→侵袭→血管形成是主要的病理生理过程[11]。“阳化气，阴成形”，EMs的无限生长、侵袭、转移的特性体现了阳主动的性质，即性善走窜，易转移到其他脏腑，具有“用为阳”的特点；其生成新生血管、形成病灶有形可见，具有“体为阴”的特点。
COX2是催化花生四烯酸转化为PGE2的诱导酶，具有刺激细胞增殖、抑制凋亡、参与细胞侵袭、远处转移和促进血管生成的作用[12-15]。研究表明伴有盆腔痛症状的EMs患者异位病灶COX2、PGE2表达水平明显升高[16]。Brenner[17]等研究认为EMs患者盆腹腔内PGE2可能诱导VEGF的表达，从而利于子宫内膜细胞形成新生血管。本实验结果显示，中、高剂量化瘀散结中药妇痛宁治疗后EMs模型病灶中VEGF表达和MVD减少，且COX2、PGE2和VEGF mRNA表达降低，提示妇痛宁可使异位病灶生成血管能力降低，血液供应减少。但各治疗组病灶中VEGF表达和MVD均比阳性对照组高，COX2、PGE2、VEGF mRNA表达也比阳性对照高，提示妇痛宁在抑制异位病灶血管生成方面仍较孕三烯酮疗效差。Snail作为E-cadherin的抑制因子，其主要功能是促进细胞的侵袭和转移[18-20]。E-cadherin是细胞间黏附和维持正常组织结构必须的蛋白，其降低与肿瘤的侵袭、转移和不良预后有关。在肺癌中过表达的COX2诱导产生的PGE2通过促进Snail的表达而抑制E-cadherin的表达，从而使细胞的侵袭、转移能力增加[21]。本实验结果显示，中、高剂量化瘀散结中药妇痛宁治疗后EMs模型病灶中参与细胞侵袭、黏附、转移的Snail mRNA和蛋白表达明显降低，E-cadherin mRNA和蛋白表达明显升高，提示妇痛宁可使异位病灶的侵袭、转移能力降低。但各治疗组病灶中Snail mRNA和蛋白表达均比阳性对照组高，E-cadherin mRNA和蛋白表达均比阳性对照组低，提示妇痛宁在抑制异位病灶的侵袭、转移能力方面尚不如孕三烯酮。
孕三烯酮是目前治疗EMs和预防术后复发的常用药物，其主要不良反应有月经不规律、闭经、肝功能损害、肥胖、痤疮、脂溢性皮炎、多毛和声音改变等，不适宜长期服用，且服药期间不能妊娠，不易被患者接受。该实验结果提示妇痛宁可通过抑制异位病灶的血管生成和降低侵袭、转移能力两方面同时达到治疗EMs的作用，即所谓“阳化气、阴成行”受阻，则新的病灶难以形成而抑制病灶的生长。化瘀散结中药妇痛宁虽治疗EMs疗效不及孕三烯酮，但服药期间无高雄激素症状、不影响月经和妊娠，可长期服用，易被患者接受。在临床中，妇痛宁可作为孕三烯酮的辅助药物，治疗和预防EMs术后的复发。
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2. Department of Gynaecology, The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300150, China