高血压是一种常见病、多发病，也是造成心、脑、肾等器官病变的重要因素之一。动脉压力反射（ABR）是机体调节血压的主要机制之一，其功能受损是在高血压的形成和维持中起重要作用。本课题组前期临床观察表明^[1-5]，针刺人迎穴可以起到良好的降压效应，但其疗效机制尚未明确。人迎穴毗邻颈动脉窦，因此其降压作用应与动脉压力反射机制有关。本研究就是利用神经示踪技术，依靠PRV-152病毒逆行跨突触传递的特点，从神经传导路径角度探讨针刺人迎穴的降压机制。实验方法及结果如下。

1 材料与方法 1.1 实验动物与分组

SPF级12周雄性SHR 大鼠45只，雄性正常Wistar大鼠15只，体质量为240~280 g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物适应环境1周后进行实验。将SHR大鼠采用随机数字表法分为：人迎组、人迎加手法组、空白对照组，每组15只；正常Wistar大鼠为正常空白对照组。

1.2 实验方法 1.2.1 针刺处理及血压测量

针刺均由专人操作，针灸针采用0.25 mm*13 mm型号（北京中研太和）。人迎组针刺人迎后留针30 min；人迎加手法组针刺人迎后行小幅度（小于90°）、高频率（每分钟120~160次）的捻转补法，施术1 min，留针30 min。于每日上午10:00-12:00之间进行针刺干预。正常空白对照组、SHR空白对照组大鼠按上述方法抓取固定5 min，但不予针刺。干预周期28 d。

分别于第1次治疗前、最后1次治疗后30 min测量血压。采用大鼠无创血压测定仪（softron BP90-A，日本软隆）测量大鼠的尾动脉收缩压，每只大鼠连续测量3次，取平均血压值。

1.2.2 病毒注射

本实验采用的示踪剂为可表达绿色荧光蛋白的伪狂犬病毒PRV-152，由华中农业大学提供，该病毒可以在大鼠体内逆行跨突触传递。不同方案干预28 d后，对各组大鼠注射病毒。大鼠麻醉后，用胶带将四肢及头部固定在泡沫板上，连线下颚角，取中间下行8 mm处向两侧量取5.5 mm，用胰岛素注射器（BD U-40 insulin），在其尖端量取5 mm深度的位置，并用记号笔做好标记，同时在立体定位仪（型号RWD68030）上进行微调，使最后深度为5 mm，达到预定深度后，在体视显微镜（型号RWD77001）下，用显微注射泵（型号Kdscientific 78-8103）注射伪狂犬病毒PRV-152，对侧注射PBS作为对照。病毒注射速度为200 μL /min，共注射6 μL，注射后继续针刺处理3天。注射结束后6至7天，动物发病，瘙痒症状明显。

1.2.3 切片制备及成像

取材当天称取质量，经复合麻醉剂（10%水合氯醛和2%氨基甲酸乙酯混合液、3 mg/mL 甲苯噻嗪溶液，3:1混合，使用剂量100 g/900 μL）麻醉后，断头取脑，放入含20% 蔗糖的 4%多聚甲醛液中固定24 h ,待组织完全下沉后,浸入30%蔗糖磷酸缓冲液中。将其制成35 μm 厚的冠状位连续冰冻切片（Lecia CM-1900恒冷切片机），切片部位：孤束核、延髓腹外测区、视上核及视上旁核。切片后，90%甘油封片，无色指甲油封边。处理后的切片在暗室内应用全电动荧光正置显微镜（品牌：奥林巴斯，型号：BX63，软件系统：cellsens standard）成像拍照并拼成全脑图。

1.3 统计方法 1.3.1 细胞计数

每只大鼠选取5张脑片，每个脑片随机选取5个视野，，在光镜下观察目标区域阳性细胞的分布情况。应用ImageJ图像处理软件选在下丘脑及延髓腹外侧截取阳性染色部位，插入标尺distance=50，清除选择图像以为的部位，改变亮度对比度、清除噪点、调节色度阈值，图像分析Size=20-Infinity，所求单位面积下所含的阳性细胞数=阳性细胞数/区域面积。

1.3.2 计数统计

应用SPSS22.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett's T3法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 针刺前后血压变化

各组大鼠原始血压值情况见表 1。经统计分析得出结果如下：

2.2 PRV阳性细胞的表达 2.2.1 PRV阳性细胞的表达部位

在人迎穴注射PRV-152病毒后，PRV染色阳性细胞在下丘脑平面主要分布在扣带后回、未定带、下丘脑、杏仁核、梨状皮质、海马回等。其中，在下丘脑中的分布主要集中在室旁核和视上核（见图 1）。PRV染色阳性细胞在延髓平面主要分布在第三小脑小叶、三叉神经中脑束、前庭内侧核、延髓腹外侧核、孤束核等（见图 2）。

2.2.2 PRV阳性细胞计数

用图片分析软件ImageJ截取观察位置（截取位置见图 3），每组选取一个血压值接近平均血压的样本对其下丘脑、延髓分别进行PRV阳性细胞计数统计（见图 4、图 5）。PRV阳性细胞计数经统计分析得出结果如下（见表 2）。

3 讨论

针刺人迎穴为主治疗高血压病是石学敏院士重要的学术思想之一^[6-7]，人迎为气海“营运之输”连接头、胸气街；交汇胆、胃两经，主司营卫开合、气血运行，针刺其穴可通调营卫、畅达气血，使血脉调和、血压稳定^[8]。

从解剖位置来看，人迎穴的解剖部位恰在颈动脉窦附近，颈动脉窦血管壁有对牵张刺激敏感的动脉压力感受器，而动脉压力感受反射（ABR）是中枢神经系统调节外周心血管功能的主要机制之一，对维持机体动脉血压的稳定性起重要作用。目前高血压病因尚未明确，但已证实压力感受器的功能异常在高血压发病过程中有重要作用^[9]，高血压早期交感神经紧张性升高，可能是导致压力反射衰减的中枢因素，压力感受器受损，对生理刺激的反应性下降，异常血压的传入信息导致中枢信息处理机能变化，不能有效抑制交感神经活性而使血压调定点上调，使动脉血压维持在较高的水平^[10]。

人迎穴的特殊断层解剖特点决定了它的降压效应需要通过ABR机制来实现，如何从解剖学角度，验证针刺人迎穴实现降压效应的ABR机制呢？神经示踪技术的出现，为此提供了手段。轴浆运输是神经元的一项基本活动，即沿其轴突有从胞体向末梢（顺向）及末梢向胞体（逆向）的物质转运，该法为研究神经元之间的联系提供了一种简便可行的方法^[11]。伪狂犬病毒（PRV）是一种嗜神经的病毒示踪剂，具有嗜神经、跨突触传递、特异性传递和不宜衰减的特点，自20世纪90年代起，国内外已经将该技术成功用于对支配周围组织和器官的中枢神经结构示踪的研究中，并在揭示针刺作用的中枢机制方面获得了成功的经验^[12]。本研究利用SHR大鼠，通过穴位注射PRV病毒作为示踪剂，病理形态学方法追踪示踪剂从穴位注射点沿神经脊髓行至下丘脑的针刺人迎穴降压作用的神经通路。研究显示，在SHR大鼠人迎穴注射PRV病毒后，由穴位部位向中枢跨突触逆向标记其神经传导路线，发现在延髓孤束核、腹外侧核及下丘脑皆有明显阳性染色，而针刺能提高其阳性表达，使相关轴浆运输通路敏感性增强，而适宜的针刺手法是影响其效应的重要因素。