类风湿关节炎（RA）是以多关节滑膜炎症为主要表现的高致残性自身免疫病，关节病理以滑膜内膜层增生,炎性细胞浸润为特征，炎性细胞进而分泌细胞因子促进炎症反应，增生的滑膜内膜衬里层产生大量的蛋白酶，是导致RA发生骨侵蚀的重要因素^[1]。目前对本病的治疗研究围绕遏制关节滑膜炎症展开，相关炎性分子中，肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-17（IL-17）作为细胞因子网络中的重要角色参与了疾病过程的慢性化^[1]，并且TNF-α和IL-6已经成为RA治疗的靶点。四妙勇安汤具有清热解毒消肿的功效，是治疗RA的经典方。本实验采用II型胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型，通过对大鼠关节炎指数（AI）积分评价、关节组织病理学及大鼠体内IL-6，IL-17，TNF-α水平的检测，探讨中药加味四妙勇安汤对CIA大鼠关节炎改善作用及分子机制。

1 材料和方法 1.1 实验动物和实验环境

SPF级雄性SD大鼠90只，体质量200~220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（许可证号：SCXK（京）2012-0001）。北京中医药大学动物实验室实验动物使用许可证号：SYXK（京）2011-0024。适应性饲养1周，室温（18±2） ℃，相对湿度60%~70%。

1.2 仪器与试剂

试剂：牛源性II型胶原蛋白（CII），购自Chondrex公司（Lot130087）；完全弗氏佐剂（CFA），购自SIGMA公司（CAS 9007-81-2）。仪器：移液器（20~200 μL），游标卡尺，电子天平，制冰机，HC-3018R高速冷冻离心机（中科中佳公司），超净工作台（SW-CJ-IFD）。

1.3 实验药物

中药加味四妙勇安汤（忍冬藤15 g，金银花15 g，玄参30 g，当归20 g，甘草10g），由北京中医药大学东方医院药剂科制剂室提供。来氟米特片（苏州长征-欣凯制药有限公司，国药准字H20000550）。

1.4 造模及分组

90只大鼠随机选出84只以备造模，另外6只为正常对照。两组大鼠周龄及体质量差别无统计学意义。

1.4.1 牛II型胶原与完全弗氏佐剂混合乳剂的配制（浓度为1mg/mL）

0．1 mL/L的冰醋酸先溶解CⅡ，浓度为4 mg/mL，放置4 ℃冰箱过夜，与CFA等体积混合，在冰浴条件下将其充分混合，完全乳化。

1.4.2 造模方法

初次免疫时（0 d），于造模组大鼠尾根部皮内注射200 μL已制备好的混合乳剂（含CII 200 μg）。加强免疫时（9 d），于大鼠尾根部皮内注射100 μL混合乳剂（含CII 100 μg），正常对照组注射等体积的生理盐水。16 d时对CIA大鼠模型进行评价。

1.4.3 模型评价标准及成模数量

AI评分标准：0分，正常。1分，明显可见的腕/踝关节轻度肿胀或局限于单个关节肿胀或少数几个关节受累。2分，中度的腕/踝关节肿胀，仅局限于单个腕/踝关节，不累及其他指间关节。3分，严重的腕/踝关节肿胀，累及足爪（足背及掌指/跖趾关节）。4分，整个肢体肿胀累及多个关节。四肢AI评分累计≥4分者视为模型成功^[2]。

1.4.4 实验分组

抽取造模成功大鼠30只，随机分为模型组，阳性药物组，中药高剂量组，中药中剂量组，中药低剂量组，每组各６只，另有已设正常对照组6只。

1.5 干预方法

正常组与模型组均给予蒸馏水10 mL/（kg·d）灌胃。阳性药组予来氟米特灌胃，剂量为1.87 mg/（kg·d）。中药高剂量组按照生药量16.4 g/（kg·d）灌胃给药。中药中剂量组按照生药量8.2 g/（kg·d）灌胃给药。中药低剂量组按照生药量4.1 g/（kg·d）灌胃给药。干预治疗12周。

1.6 观察指标 1.6.1 大鼠一般情况

毛色、形态，活动情况，体质量。

1.6.2 大鼠AI积分变化

干预治疗后每周1次对各组每只大鼠的四肢分别进行AI评分，累计得出每只鼠的关节总AI积分，观察关节炎指数变化情况。

1.6.3 大鼠右踝关节组织病理学变化

干预治疗12周后，10%水合氯醛麻醉，取右踝关节放入10%甲醛溶液固定，将固定好的右踝关节取材、脱钙后，流水冲洗数小时，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后，4 μm切片，进行苏木精-伊红（HE）染色，光镜观察关节滑膜被覆上皮有无变性、增生，间质有无炎细胞浸润及肉芽组织形成；关节腔有无减小或闭塞，关节软骨有无破坏或纤维化，关节周围软组织有无炎性细胞浸润或纤维化。

1.6.4 大鼠滑膜组织及血清IL-6、IL-17、TNF-α含量

干预治疗12周后，10%水合氯醛麻醉，取血2 mL，离心，取上清液备酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测。大鼠处死后，在冰皿上快速切取双膝关节滑膜，置于5 mL冻存管中，放入液氮，以备做逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测。

1.6.4.1 RT-PCR技术检测大鼠滑膜组织IL-6、IL-17、TNF-αmRNA转录水平

取大鼠关节滑膜组织，使用Trizol试剂提取RNA后，进行一步法RT-PCR反应，检测IL-6、IL-17、TNF-α的mRNA转录水平。反应体积为25 μL，反应体系含样本RNA 2 μL，10Pmol引物各0.8 μL。IL-6、IL-17、TNF-α基因序列：针对IL-6基因序列的上下游引物分别是：5-CCCTGACTGGCTAAAGGACA-3和5-CAGTACAG-CCGCCTTCT AGG-3；针对IL-17基因序列的上下游引物分别是：5-TACAACCTCCTTGCAGCTCC-3和5-GGATCTTCATGAGGTGTCAGTC-3；针对TNF-α基因序列的上下游引物分别是：5-GGATCTCAAAGACAACCAAC-3和5-ACAGAGC-AATGACTCCAAAG-3；针对看家基因GAPDH基因序列的引物分别是：5- CCCATCTATGAGGGTTAC-GC -3和5-TTTA ATGTCACGCACGATTTC -3。扩增条件为：42 ℃灭活5 min，95 ℃变性10 s，95 ℃退火5s，60 ℃延伸34 s，共40个循环。反应结束后进行熔解曲线分析，以鉴定PCR产物的特异性。使用SDS软件分析RT-PCR过程各检测样本的Ct（Threshold of cycle）值。

1.6.4.2 ELISA技术检测大鼠血清IL-6、IL-17、TNF-α蛋白表达水平

按照试剂盒说明书要求，顺序规范操作。

1.7 统计学处理

应用SPSS 18.0统计软件。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，对不同组间同一时点的关节炎指数，体重及细胞因子测量数据比较用单因素方差分析，组间两两比较时若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 加味四妙勇安汤对大鼠一般情况的影响

正常对照组大鼠皮毛光泽，较活泼，纳食正常，其余各组皮毛光泽度较差，轻度脱毛，动作迟缓，纳食较少，体重增长较慢。除正常对照组以外，各组大鼠均表现有关节肿痛，活动减少，关节活动受限甚至强直。其中模型组大鼠在治疗期间，表现得相对明显。整个治疗期间内，模型组大鼠体质量较正常组显著减低（P＜0.01）,各治疗组大鼠较模型组大鼠体质量差异无统计学意义。见表 1。

2.2 加味四妙勇安汤对大鼠关节总AI积分的影响

在治疗期间，与正常组比较，模型组大鼠关节总AI积分在0~4周，6~12周均有显著升高（P＜0.05或P＜0.01），提示模型成功，且较稳定。与模型组比较，各治疗组的总AI积分总体呈下降趋势。阳性对照药组在7~12周时关节总AI积分明显降低，具有统计学差异（P＜0.05或P＜0.01）。中药3种剂量组在6~12 周时AI分值较模型组明显下降（P＜0.05或P＜0.01）；而且在8~10周还分别表现出短期内较阳性药物组显著的改善（P＜0.05或P＜0.01）。见表 2。

2.3 加味四妙勇安汤对大鼠右踝关节组织病理的影响

正常组大鼠右踝关节面光滑，软骨细胞排列整齐，关节周围组织未见炎性细胞浸润。模型组大鼠右踝关节软骨滑膜被覆上皮细胞轻度增生，关节腔缩小，周围软组织见轻度纤维增生，轻度炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主。阳性药物组：关节面光滑，软骨细胞排列整齐，关节周围组织未见炎性细胞浸润。加味四妙勇安汤高、中剂量组：关节周围软组织见轻度纤维组织增生，未见炎性细胞浸润，滑膜、软骨等较模型组未见明显差异。加味四妙勇安汤低剂量组：关节滑膜增生，有少量淋巴细胞浸润，关节软骨纤维化，周围软组织有轻度纤维组织增生，较模型组无统计学差异。见图 1。

2.4 加味四妙勇安汤对大鼠膝关节滑膜组织IL-6、IL-17、TNF-α的mRNA转录水平的影响

与正常组比较，模型组大鼠关节滑膜IL-6、IL-17、TNF-α mRNA转录水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，阳性药物（来氟米特）组、中药高、中、低剂量组IL-6、IL-17、TNF-α mRNA转录水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。见表 3。

2.5 加味四妙勇安汤对大鼠血清IL-6、IL-17、TNF-α蛋白表达水平的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清IL-6、IL-17、TNF-α蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，阳性药物（来氟米特）组、中药高、中、低剂量组IL-6、IL-17、TNF-α 蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表 4。

3 讨论

几乎所有的血清学阳性的RA患者滑膜组织中分离出的B细胞，都可以活跃地分泌Ⅱ型胶原抗体^[3]。Ⅱ型胶原诱导型关节炎（CIA）即是通过Ⅱ型胶原混合弗氏佐剂，注射入动物体内，诱发其产生抗Ⅱ型胶原的IgG型抗体，引起动物慢性增殖性滑膜炎，进而发生软骨与骨的破坏，导致关节肿热，甚至强直的关节炎动物模型^[4]。由于CIA模型存在对Ⅱ型胶原的强烈免疫反应，在关节肿胀、组织病理学和影像学改变方面均与RA极为相似^[5-6]，且CIA大鼠血清及组织中可见TNF-α，IL-17及IL-6等多种细胞因子的高表达，已成为目前评价RA治疗的经典模型。本实验也从病理及细胞因子检测两方面观察到CIA大鼠在成模后12周，具备RA活动期的免疫炎性病理损伤特点。

四妙勇安汤为治疗RA急性发作期常用方剂。CIA模型表现出四肢多关节红肿热痛，急性起病，慢性进展，与RA患者活动期较为常见的痰热瘀毒痹阻经络关节^[7]的征象相似，而且对清热解毒，化瘀通络的中药反应较好^[8]，更加符合热毒瘀结证型。因此采用CIA模型大鼠作为研究对象，能够较好的模拟加味四妙勇安汤适用的证型。

AI总积分的动态变化反映出，药物干预6周后，AI总积分在各治疗组与模型组间差异较明显。中药各组分别在治疗第8、9、10周出现AI总积分显著低于阳性对照药物组，而在11周以后各治疗组间AI总分无统计学差异。提示中药与阳性对照药来氟米特的起效时间均在5周以后，起效早期，加味四妙勇安汤的治疗作用更强。

病理结果证实了CIA大鼠模型组的滑膜增生，炎性细胞浸润，符合RA关节病理特征，中药中剂量组对CIA大鼠关节炎性病理损伤有改善作用。但在中药高、低剂量组中观察到了物理指标的改善，未见明显病理改善，而在阳性药物组、中药中剂量组同时见到了两方面的改善，提示：1）中药3剂量组中，中等剂量组的量效关系最佳。加味四妙勇安汤与阳性对照药均能够改善CIA病情，而不是仅有消缓肿胀症状的作用。2）本实验模拟的是一种慢性自身免疫性炎症，12周的治疗期对CIA大鼠来说，时间较短，这可能是中药高、低组关节炎症体征好转，病理改善不明显的原因，如果延长治疗期，疗效或许更为显著。

分子水平的研究已表明，尽管在RA发生的机制路径上有众多的炎性因子参与其中，但TNF-α，IL-17及IL-6以其在RA的细胞因子网络中的重要作用备受瞩目。TNF-α是RA滑膜炎症反应的关键性细胞因子，具有多种炎性和免疫反应活性，几乎参与RA炎症反应的所有环节，在RA滑膜炎、骨及软骨的破坏中起非常重要的作用^[9]。Th17细胞/调节性T细胞亚群失衡在RA发病中具有极为重要的作用，且以Th17细胞占优势^[10]。活化的Th17细胞分泌多种前炎症细胞因子，其中最具特征的就是IL-17，具有促产生炎性细胞因子（如IL-6、TNF-α），趋化因子和基质金属蛋白酶的表达，引起炎性浸润和组织破坏的作用^[11]。IL-17还能激活多种参与RA发病的细胞类型，包括滑膜成纤维细胞、单核细胞、巨噬细胞、软骨细胞及成骨细胞^[12]。IL-6是一种促炎细胞因子，通过促进炎症细胞聚集、刺激滑膜血管翳形成、破骨细胞活化等，可导致关节炎症及骨破坏，在RA 的进程中起关键作用^[13]。IL-6促进Th17的活化，活化的Th17细胞又分泌IL-17等多种前炎性因子，而IL-17能进一步促进IL-6、TNF-α等细胞因子的释放和其他致炎细胞的激活^[14]。这种瀑布样叠加的炎症激活作用，导致RA免疫炎性损伤进展及滑膜血管翳形成、软骨与骨受到破坏。本研究证实加味四妙勇安汤能显著下调CIA大鼠体内IL-6，IL-17，TNF-α的mRNA转录水平及蛋白表达。提示该药可能是通过下调这些RA发病机制中的关键细胞因子，而抑制了炎性细胞因子网络的活跃状态，从而减轻自身免疫反应，以达到缓解RA症状，改善病理损伤的作用。