心血管疾病（CVD）是慢性肾脏病（CKD）患者最常见的并发症，相关资料显示，CKD病人死于CVD者在其总死亡率中高达30%~50%^[1]。英国的流行病学调查亦显示CVD是CKD患者死亡的首位原因，约46%的CKD患者死于并发的CVD^[2]。在近年来的临床研究中, 人们已经注意到, 如果在慢性肾脏病早期加以适当的干预, 就可以延缓肾功能损害的进展, 并且可以减少心血管合并症的发生和慢性肾脏病患者的总体死亡率。

血管平滑肌细胞（VSMCs）的增殖、凋亡和迁移是动脉粥样硬化斑块形成的主要病理生理机制。通过抑制血管平滑肌细胞的过度增殖凋亡和迁移，就可以延缓动脉粥样硬化斑块的形成，抑制血管重构，从而减少心血管疾病的发生^[3-4]。辛通畅络中药复方对糖尿病肾病、局灶性节段性肾小球硬化、系膜增生性肾炎等多种肾脏疾病均有较好疗效^[5-7]。本实验通过确定辛通畅络中药复方对大鼠的VSMCs迁移的影响，以期解析该复方防治动脉粥样硬化（AS）及CVD的机制，为辛通畅络中药复方的临床应用提供有效的理论依据。

1 实验材料与试剂

胎牛血清（FBS）、Boyden小室、DMEM培养基（天津子涵生物科技有限公司）。β－actin、异硫氰酸荧光素酯（FITC）标记的鼠抗（武汉博士德有限公司）；MMP－2、MMP－9抗体（Cell Signaling Technology公司，美国）、HRP标记的山羊抗兔/抗鼠二抗（Rockland公司，美国）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（产品编号P0012）、ECL试剂、一抗二抗稀释液、细胞裂解液（北京碧云天有限公司）。

2 方法 2.1 实验动物及分组

SPF/VAF级Spragoe-Dawleg（SD）远交系健康雄性大鼠48只，体质量为250~300 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司（许可证号：SCXK京2012－0007）。适应性饲养7 d后随机分为10%、20%、30%中药血清组和空白对照组，每组12只。

2.2 辛通畅络中药复方药物及含药血清的制备

辛通畅络中药复方各药量为：柴胡12 g，生黄芪30 g，黄芩10 g，女贞子15 g，当归10 g，水蛭10 g，泽兰15 g，细辛3 g。以上8味中药共煎煮3次，煎液混合后加热浓缩至含生药量4g /mL，无菌装瓶密封保存。大鼠按体质量15 g/kg灌胃给药，每日1次，连续灌服10 d，于最后一次给药后的2~3 h股动脉取血，分离血清，经56 ℃，30 min灭活后，配成含10%、20%、30%中药血清的3组血清溶液备用, 以未服药大鼠的血清为对照。

2.3 VSMCS的培养和鉴定

用组织贴块法来培养VSMCS，经α-actin免疫组化鉴定为VSMCS，第3~5代细胞用于实验。

2.4 细胞干预分组

待细胞生长至70%~80%融合后，换用无FBS的DMEM培养液饥饿培养16 h，使细胞处于静止期。根据不同处理将细胞分为4组，1）空白对照组：未服药大鼠的空白血清。2）10%中药血清组。3）20%中药血清组。4）30%中药血清组。培养48 h后收集细胞用于本实验。

2.5 细胞迁移能力 2.5.1 Boyden小室法

上、下室间为硝酸纤维素滤膜（孔径8 μm），上室分别加入静止的空白对照组、10%、20%、30%中药血清组细胞2.5×10⁴个，下室加入200 μL含8%胎牛血清的DMEM培养基。在细胞培养箱内静置培养6 h后，取出滤膜, 用棉签将滤膜上室面的细胞擦掉，用95%乙醇固定10 min, 苏木精-伊红（HE）染色5~10 min，光镜下计数下室面的细胞数。每组重复8次。

2.5.2 细胞划痕实验

在细胞生长至70%~80%融合后，用200 μL移液枪枪头在细胞生长的6孔板上划一细痕。PBS洗去被刮下的细胞，继续培养72 h，低倍镜下观察细胞迁移情况。任取3个视野计数迁移细胞的数量。

2.6 蛋白免疫印迹法（WesternBlot）检测

MMP-2、MMP-9蛋白的表达首先使细胞同步于Go/Gl期。加入裂解液裂解细胞，提取细胞蛋白。采用BCA法检测各组总蛋白浓度，调整蛋白浓度，100 ℃水浴10 min使蛋白变性。各组取30 μg蛋白样品于SDS-PAGE凝胶中电泳分离，电转蛋白质至PDVF膜，封闭1 h，分别加入MMP-9（1:200）、MMP-2（1:200）、β-actin（1:1 000）一抗，孵育后4 ℃过夜，TBST洗膜3次，每次10 min。相应HRP标记二抗（1:5 000），室温孵育l h，TBST洗膜3次，使用ECL试剂盒显色后用凝胶图像处理系统扫描成像并分析两种蛋白的表达水平。

2.7 统计学方法

采用SPSS l8.0统计软件分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多样本均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果 3.1 Boyden小室法实验结果

与空白对照组相比较，10%中药血清组VSMCS迁移数略有减少，但差异无显著性；20%及30%中药血清组VSMC迁移数与对照组及10%中药血清组相比明显减少，差异具有显著性（P＜0.05），同时30%药物组较20%药物组VSMCS迁移数明显减少，且差异具有显著性（P＜0.05）。由此推断：辛通畅络中药复方可以抑制血管平滑肌细胞迁移，并且这种抑制效应呈浓度依赖性。见表 1。

3.2 细胞划痕实验结果

与正常对照组相比较，10%、20%及30%中药血清组VSMCS迁移数均减少，且差异具有显著性（P＜0.05）；20%中药血清组VSMCS迁移数较10%中药血清组明显减少，差异具有显著性（P＜0.05），同时30%差异较20%差异VSMC迁移数明显减少，且差异具有显著性（P＜0.05）。由此可见：辛通畅络中药复方可以抑制血管平滑肌细胞的迁移，并且这种抑制效应呈浓度依赖性。见表 2。

3.3 对VSMCS的MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

与空白对照组相比较，10%、20%及30%中药血清组的MMP-2、MMP-9蛋白表达均减少，且差异具有显著（P＜0.05）；其中，20%中药血清组MMP－2、MMP－9蛋白表达较10%中药血清组明显减少，差异具有显著性（P＜0.05），同时30%中药血清组较20%中药血清组MMP－2、MMP－9蛋白表达亦明显减少，差异具有显著性（P＜0.05）。结果显示：辛通畅络中药复方可以抑制VSMCS的MMP－2、MMP－9蛋白表达，并且这种抑制效应呈浓度依赖性。见表 3。

4 讨论

慢性肾脏病的早期即可出现动脉粥样硬化（AS），从而导致血管病变即血管重构。AS是一个全身的病变，主要侵犯大中型动脉，冠状动脉和颈动脉常同时受累，病变主要累及到主动脉、冠状动脉、脑动脉、肾动脉、大、中型肌弹力型动脉，最终导致它们的管腔狭窄以至完全堵塞，使这些重要器官缺血缺氧、功能障碍以至机体死亡^[8-10]。

VSMCS是决定血管活性和血管构型的重要因素，其异常增殖、迁移及凋亡是AS等疾病的主要病理过程之一。因此，调节VSMCS的增殖、迁移及凋亡就能够有效地防治AS等相关疾病，从而寻求一种安全可靠的针对VSMCS的药物来达到预防及治疗上述疾病，已成为该领域研究中的热点。

辛通畅络中药复方是天津中医药大学第一附属医院肾内科依据多年的相关肾病临床经验的积累，建立的以疏利少阳法为主，融益气养阴，清热利湿，辛通畅络、活血化瘀为一体的中药复方制剂。研究表明辛通畅络中药复方能够诱导VSMCS凋亡，证明了该药具有抑制动脉粥样硬化以及血管重塑的作用，可以保护心血管、预防CKD患者心血管并发症的发生，减慢CKD患者疾病的进展速度，最终提高CKD患者生存率和生活质量^[11]。

为观察辛通畅络中药复方对VSMCS迁移能力的影响，本研究采用划痕实验及Boyden小室法发现，该中药血清可显著抑制VSMCS迁移。VSMCS从血管中膜向内膜下迁移时需要对细胞外基质（ECM）进行降解，而VSMCS降解ECM的机制为分泌基质金属蛋白酶（MMPs）^[12-13]。为进一步研究辛通畅络中药复方抑制VSMCS迁移的作用机制，本研究检测了该中药血清对VSMCS中MM-2、MMP-9蛋白表达的影响。

研究发现VSMCS的迁移能力受MMP-2、MMP-9表达水平的影响^[14-15]。MMP-2是VSMC表达和分泌的最主要的MMP，具有强烈的胶原酶与明胶酶活性，是VSMC在穿过内弹力板基底膜等屏障过程中的一种必需物质^[16]。动物大动脉球囊损伤模型显示：球囊损伤的后期以MMP-2为主发挥促VSMC迁移作用^[17]。MMP-9在内膜病变、VSMCS迁移中同样起着重要作用。有研究认为MMP-9是VSMCS迁移和内膜增生的主要调节物^[18-19]。动物实验发现：在转染MMP-9cDNA大鼠模型上，MMP-9的过度表达促使VSMCS向动脉基质层迁移增多，敲除MMP-9则可以阻止VSMCS的异常迁移和新生内膜形成^[20-21]。在人主动脉血管平滑肌离体实验中也发现细胞迁移总是伴随着MMP-9的合成和活性增加^[22]。这些研究至少可以证明MMP-2和MMP-9参与了血管损伤后VSMCS的增殖、迁移以及新生内膜形成过程。抑制MMP-2和MMP-9活性可作为治疗动脉粥样硬化的一种策略^[23]。

本实验结提示随着药物浓度的提高，VSMCS细胞的迁移数量显著减少，提示辛通畅络中药复方能够抑制血管平滑肌细胞迁移，证明了该药具有抑制动脉粥样硬化以及血管重构的作用，可以保护心血管、预防CKD患者心血管并发症的发生，减慢CKD患者疾病的进展速度，最终提高CKD患者生存率和生活质量，提高社会复归率。