子宫内膜异位症（EMS）是妇科常见病、多发病，发病率达10%~15%^[1]，且呈上升趋势，它所引起的疼痛、不孕和包块，严重影响女性的健康和生活质量。EMS病变广泛，形态多样，极具侵袭性和复发性，不仅有恶性行为且有组织学恶变倾向，已成为妇产科临床与基础研究之焦点和难点。中医认为“瘀血”是子宫内膜异位症的发病基础，活血化瘀法是本病的基本治则^[2]，且临床疗效显著^[3]。新近研究认为EMS是一种“干细胞起源”的疾病^[4]。本课题组前期从EMS患者在位子宫内膜功能层中分离出子宫内膜干细胞^[5]，本研究试图通过体内、外研究探讨活血化瘀代表方剂姜黄散对EMS子宫内膜干细胞的影响。

1 材料 1.1 子宫内膜标本

14例经手术确诊为EMS患者的在位子宫内膜标本均为术前经阴道诊刮获得，将新鲜子宫内膜标本置于含2%青链霉素的冰浴DMEM/F-12培养基（DF12）中，立即送入实验室进行分离培养。患者年龄26~50岁，术前3个月未服用激素类药物，不合并其他内科疾病，诊刮病理证实子宫内膜无病变。所有标本的采集均经患者本人知情同意，并经医院伦理委员会批准。

1.2 实验动物

经天津中医药大学第二附属医院伦理委员会审查同意，4周龄健康SPF级雌性裸鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，体质量为13~16 g，饲养于中国医学科学院血液学研究所无菌净化屏障系统内饲养。

1.3 药品与试剂

姜黄散：姜黄、丹参、莪术、赤芍各10 g，均来自天津中医药大学第二附属医院全成分颗粒药房。孕三烯酮标准品（中国药品生物制品检定所，CAS号：16320-04-0）。DF12、标准胎牛血清（FBS）（美国Hyclone公司），间充质干细胞培养液（MSCGM）（德国Lonza公司）。

2 方法 2.1 细胞培养

EMS在位子宫内膜干细胞的分离、培养及鉴定方法参照本课题组前期实验成果^[5]。

2.2 药液制备

姜黄散全成分颗粒热溶后离心去沉渣，0.22 μm滤膜过滤除菌，配置母液浓度为400 mg/mL。孕三烯酮标准品以二甲基亚砜（DMSO）溶解后配置母液浓度为1×10^-2 mol/L。

2.3 姜黄散在体外实验中对子宫内膜干细胞的影响 2.3.1 姜黄散对子宫内膜干细胞增殖的影响

子宫内膜干细胞以1×10⁴/孔密度接种于96孔板中，分为姜黄散实验组、孕三烯酮阳性对照组及不加药阴性对照组，每组设6个复孔。细胞贴壁融合至约60%时各组加药继续培养48 h，以0.5 mg/mL的噻唑蓝（MTT）100 μL继续与细胞共培养4 h后添加DMSO避光震荡5 min，酶标仪读取各孔490 nm处光密度（OD）值，以抑制率（IR）接近10%作为药物对子宫内膜干细胞干预的最高无毒浓度。IR=（A490阴性对照-A490加药）/A490阴性对照×100%。

同上法，将子宫内膜干细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁融合至约60%时，实验组加入最高无毒浓度浓度姜黄散，阳性对照组加入最高无毒浓度浓度孕三烯酮，阴性对照组正常培养不加药，MTT法分别检测培养3、6、12、24、48 h各组细胞490 nm处OD值，计算实验组及阳性对照组加药后IR进行统计分析。

2.3.2 姜黄散对子宫内膜干细胞克隆形成的影响

1）将子宫内膜干细胞以50个细胞/cm²接种于6孔板中，分为姜黄散实验组、孕三烯酮阳性对照组及不加药阴性对照组，每组3个复孔，待细胞贴壁后，各组换成含最高无毒浓度药物培养液继续培养12 d。以4%多聚甲醛固定细胞，以姬母萨染液1 mL/孔将细胞染色后计数克隆，按公式“克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%”计算克隆形成率，评价姜黄散对子宫内膜干细胞克隆形成的影响。2）同上法接种克隆，连续培养12 d后计数克隆形成并进行统计，将克隆形成细胞同上分组并加药干预48 h，将细胞固定、染色，计算克隆形成率，评价姜黄散对子宫内膜干细胞克隆形成的影响。

2.3.3 姜黄散对子宫内膜干细胞微球体形成的影响

1）将子宫内膜干细胞分为姜黄散实验组、孕三烯酮阳性对照组及阴性对照组，各组分别用含最高无毒浓度药物MSCGM重悬后，以4×10⁵/皿密度接种于直径为6 cm的超低吸附培养皿中，每2天加入1 mL含药MSCGM，4 d后倒置，显微镜下观察微球体变化，评价姜黄散对子宫内膜干细胞微球体形成的影响。2）用MSCGM重悬子宫内膜干细胞，培养4 d待微球体形成后将细胞同上分组并加药继续培养48 h，观察加药后微球体变化，评价姜黄散对子宫内膜干细胞微球体形成的影响。

2.4 姜黄散在体内实验中对子宫内膜干细胞的影响

将子宫内膜干细胞以1×10⁷个细胞/部位接种于裸鼠下腹部4个象限部位，共40个接种点。饲养2周观察裸鼠皮下异位病灶生长情况，游标卡尺测量病灶长径（b）、短径（a），并计算病灶体积[V=1/2（a×b²）]。形成病灶的裸鼠随机分为姜黄散高剂量组（254.7 mg/d），中剂量组（127.35 mg/d），低剂量组（63.675 mg/d），孕三烯酮阳性对照组（每周15.92 μg）及阴性对照组（生理盐水200 μL/d），每组8个异位病灶。姜黄散各组及阴性对照组连续灌胃14 d，阳性对照组灌胃孕三烯酮水溶液2次/周，共2周，计算各组异位病灶体积。

处死裸鼠，取裸鼠异位病灶组织以4%多聚甲醛固定后浸蜡包埋、切片，应用苏木精-伊红（HE）染色观察异位病灶组织结构，用免疫组化法（SP）检测裸鼠异位病灶表面蛋白Vimentin和CK-19的表达，以确定病灶性质，并于显微镜下计数异位病灶腺体数量。

2.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学处理。定量资料以均数±标准差（x±s）表示，组内自身前后比较采用配对t检验，两组均数比较采用两独立样本t检验，多组均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD法，重复测量资料采用重复测量方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 姜黄散对子宫内膜干细胞增殖的抑制作用

姜黄散对子宫内膜干细胞干预的最高无毒浓度为20 mg/mL，孕三烯酮为10^-6 mol/L。姜黄散和孕三烯酮对子宫内膜干细胞作用6 h后表现出抑制作用，12 h后抑制作用明显，24 h后抑制作用加快，到48 h抑制率接近10%，相同时间二者作用趋势一致（见表 1），各时间段两组抑制率均无统计学差异。

3.2 姜黄散抑制子宫内膜干细胞的克隆形成

子宫内膜干细胞贴壁后即加药干预，继续培养12 d后，实验组未见克隆形成，阳性对照组克隆形成率为（2.35±1.23）%，均明显低于阴性对照组（16.20±3.05）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。

各组细胞接种12 d后计算克隆形成率无统计学差异（见表 2），加药干预48 h后，实验组和阳性对照组均可见已形成的克隆中有细胞凋亡，克隆细胞排列变稀疏，大克隆数目明显减少（见图 1）；实验组和阳性对照组分别与加药前比较有统计学差异（见表 2，P＜0.05）。阴性对照组较前无统计学差异。

3.3 姜黄散抑制子宫内膜干细胞的微球体形成

在微球体形成前加药干预，实验组及阳性对照组均未见微微球体形成，阴性对照组微球体则正常形成。

在微球体形成后加药干预，实验组微球体直径明显变小，部分较小的微球体结构松散，漂浮状态的单个细胞及贴壁细胞数量增多；阳性对照组微球体直径明显变小或贴壁，贴壁细胞数量增多明显；阴性对照组微球体则正常形成（见图 2）。

3.4 姜黄散对裸鼠异位病灶的抑制作用

药物干预前，各组裸鼠异位病灶体积无统计学差异（见表 3，P>0.05）。药物干预后，姜黄散高、中剂量组及阳性对照组皮下均未见肉眼可见的异位病灶，姜黄散低剂量组裸鼠异位病灶体积较前减小（P＜0.05），阴性对照组异位病灶体积较前无统计学差异。

对各组接种部位组织进行HE染色及免疫组化病理鉴定，镜下均可见子宫内膜异位病灶样间质及腺体存在。与阴性对照组比较，姜黄散高、中剂量组及阳性对照组异位腺体数量均明显降低，结果有统计学差异（见表 4，P＜0.05），但姜黄散高、中剂量组与阳性对照组比较无统计学差异。姜黄散低剂量组腺体数量与阴性对照组无统计学差异。

4 讨论

干细胞是具有无限增殖、自我更新和多向分化潜能的细胞群，在体内和体外均有表现。在体外，干细胞的无限增殖、自我更新和多向分化的潜能可以表现在克隆形成^[6]，微球体形成^[7]和诱导分化^[8]等。在体内，干细胞可以表现为相近组织的重建或肿瘤形成^[9]，这是评价干细胞生物学特性的金标准。EMS被称为“不死的肿瘤”，其增殖、浸润、转移及复发等恶性生物学行为^[10]与干细胞的生物学特性密切相关。

EMS起源的“干细胞学说”认为在位子宫内膜基底层的干/祖细胞异常脱落进而逆流入盆腔，在局部微环境的刺激诱导下进入增殖、分化程序最终发展为子宫内膜异位病灶，即EMS起源于在位内膜干细胞。该理论使EMS经典的“经血逆流学说”与“在位内膜决定论”得到整合与融通。而中医理论认为EMS形成的最主要原因是瘀血。妇女房劳、多产、手术等均易损伤冲任胞宫，致藏泄功能异常，经血泄而不循常道，成为离经之血。离经之血与荣养周身的正常血液不同，可随经络气血运行至周身他脏，瘀阻他处，是为“瘀血”，与周围组织粘连、纤维化，形成疤痕，瘀积日久，可于机体多部位形成癥瘕，故瘀血始终贯穿EMS病理演变的全过程。离经之血犹如“种子”一样的在位内膜干细胞，瘀血不除，血不归经，则反复发病。临床研究显示，活血化瘀法是中医治疗EMS的基本治则，且在该治则指导下取得满意临床疗效，不良反应少，被EMS患者广泛接受^[11-12]。本研究前期已从EMS患者在位子宫内膜功能层中分离出子宫内膜干细胞，本研究从体、内外实验进一步观察活血化瘀法对EMS的干预作用。

本研究所用姜黄散首载于《圣济总录》，主治“妇人月水涩滞”、“脐腹刺痛”，是活血化瘀治法的代表方剂。实验所用姜黄散在原方基础上合理化裁，由姜黄、丹参、莪术、赤芍组方，提高原方活血化瘀，理气止痛之功，活血不伤正，理气不伤阴，相辅相成，使气血流利，通则不痛，癥瘕自除。研究结果显示姜黄散可有效抑制子宫内膜干细胞的增殖、克隆形成及微球体形成，予姜黄散干预后，裸鼠异位病灶体积明显减小，异位腺体数量明显减少，作用效果与孕三烯酮相当，明显高于不予药物干预的阴性对照组。以上实验结果提示活血化瘀法具有抑制子宫内膜干细胞增殖的作用，为活血化瘀法治疗EMS提供基础理论依据，有利于治疗EMS中药新药的开发与利用，为传统中医理论得到现代医学的认可奠定基础。