2017, Vol. 34文章信息
- 许光远, 孙文, 宋紫临, 郭璇, 吴丽丽, 秦灵灵, 侯丹, 张茁, 田硕, 李响, 刘铜华
- XU Guang-yuan, SUN Wen, SONG Zi-lin, GUO Xuan, WU Li-li, QIN Ling-ling, HOU Dan, ZHANG Zhuo, TIAN Shuo, LI Xiang, LIU Tong-hua
- 异槲皮苷对db/db小鼠肝脏脂肪酸代谢及相关基因表达的影响
- Improvement of Isoquercitrin on liver fatty acid metabolism-related gene expression in db/db mice
- 天津中医药, 2017, 34(11): 778-781
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2017, 34(11): 778-781
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2017.11.17
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文章历史
- 收稿日期: 2017-06-14
2. 北京中医药大学中医养生学教育部重点实验室, 北京 100029;
3. 陕西中医药大学第一附属医院老年病科, 咸阳 712046;
4. 河北工程大学医学院, 邯郸 056000
2001年美国糖尿病协会（ADA）会议指出, 脂代谢异常与2型糖尿病的关系密切。高游离脂肪酸引起脂毒作用，导致胰岛素抵抗和糖尿病；而胰岛素抵抗与糖尿病状态下，脂肪酸氧化供能成为机体的主要能量来源。因此，维持脂肪酸合成、氧化的动态平衡至关重要，任何途径障碍，都将导致脂肪酸在血和组织中聚集，加重胰岛素抵抗和糖尿病。
异槲皮苷是一种黄酮类活性物质，具有多种生物活性，如抗炎抗氧化、神经保护等[1-3]，最新研究发现异槲皮苷通过激活Wnt/β-catenin信号通路抑制脂肪细胞分化[4]，以及调节AMPK信号通路改善肝细胞脂质代谢[5]，但并没有整体动物实验证明其干预脂质代谢的具体机制，因此，本研究通过观察异槲皮苷对自发性2型糖尿病模型db/db小鼠脂肪酸代谢紊乱的影响，旨在探讨其调控肝脏脂肪酸代谢的机制。
1 材料 1.1 实验动物8周龄SPF级雄性db/db小鼠12只，同周龄雄性C57BL/6J小鼠8只（南京大学生物医药研究院，许可证编号：SCXK（苏）2010-0001）。小鼠饲养于北京动物实验中心SPF级动物实验室，温度（23±2）℃、湿度（55±10）%，12/12 h光照黑暗循环，自由摄食饮水。db/db小鼠喂养全价高脂饲料（基础饲料78.8%，蛋黄粉10%，猪油10%，胆固醇1%，胆盐0.2%）；C57BL/6J小鼠喂养普通全价营养颗粒鼠饲料。
1.2 药物与试剂、仪器异槲皮苷（成都普瑞法科技开发有限公司，批号：14013103）；葡萄糖测定试剂盒（葡萄糖氧化酶法，产品编号：YZB/京0111-2013）、总胆固醇测定试剂盒（COD-PAP法，产品编号：YZB/京0698-2010）、甘油三酯测定试剂盒（GOP-PAP法，产品编号：YZB/京06997-2010）均购自中生北控生物科技股份有限公司；游离脂肪酸（FFA）试剂盒（北京华英生物技术研究所，批号：HY-N0057）；GoScriptTM Reverse Transcription System、GoTaq® qPCR Master Mix（Promega公司，批号：0000076581）；SREBP1c，FAS，Sirt1，PGC1αPPARα，CPT1α mRNA引物[生工生物工程（上海）股份有限公司合成]；PCR扩增仪（Applied Biosystems 7500）；酶标仪GLOMA MULTI DETECTION SYSTEM（Promega公司）；光学显微镜（OLYMPUS公司，BX53型）。
2 方法 2.1 分组与给药db/db小鼠适应性喂养1周后，尾静脉采血检测血糖，小鼠血糖＞16.7 mmol/L，按血糖值随机分层分组，为模型组、异槲皮苷组，每组6只；另选6只健康雄性C57BL/6J小鼠为正常对照组，共18只；异槲皮苷组灌服异槲皮苷水溶液50 mg/kg；给药浓度按0.01 mL/g体质量，其余组给以等体积的生理盐水，1次/d，连续给药4周。
2.2 一般情况观察及生化指标检测观察各组小鼠一般状态，记录体质量（1次/周）。给药4周后，禁食不禁水12 h，麻醉后眼眶静脉取血，离心抽取血清，检测各组小鼠空腹血糖（FBG）、总胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、游离脂肪酸（FFA）。
2.3 肝质量及肝质量/体质量检测给药干预4周后，禁食不禁水12h后称质量麻醉，取血后解剖，摘取小鼠肝脏称质量；计算肝质量/体质量。
2.4 肝脏苏木精-伊红（HE）染色取材，将肝脏放入10%中性福尔马林迅速固定24 h后，常规石蜡包埋，5 μm切片，采用HE方法染色：石蜡切片常规二甲苯、梯度酒精脱蜡至水，苏木精染液5 s，自来水返蓝10 min，1%HCL-Alc分色30 s，伊红染液5 s，梯度酒精、二甲苯脱水，中性树胶封片。光镜下观察肝脏病理变化。
2.5 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）测定取液氮冻存的小鼠肝组织，Trizol法提取组织总RNA。GoScriptTM Reverse Transcription System试剂盒进行反转录，Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System进行反应，反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min（共40次循环）；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s溶解。引物如表 1所示。
| 引物名称 | 引物序列 | 引物长度（bp） |
| SREBP1c | F：5 ‘-CCATCGACTACATCCGCTTCTT-3’ | 22 |
| R：5’-ACTTCGCAGGGTCAGGTTCTC-3’ | 21 | |
| FAS | F：5’-CTGCGGAAACTTCAGGAAATG-3’ | 21 |
| R：5’-GGTTCGGAATGCTATCCAGG-3’ | 20 | |
| Sirt1 | F：5’-TCGTGGAGACATTTTTAATCAGG-3’ | 23 |
| R：5’-GCTTCATGATGGCAAGTGG-3’ | 19 | |
| PGC1琢 | F：5’-TGCCATTGTTAAGACCGAG-3’ | 19 |
| R：5’-GGTCATTTGGTGACTCTGG-3’ | 19 | |
| PPAR琢 | F：5’-CCTGCTTCCTGCCACTTG-3’ | 18 |
| R：5’-GTTCACCCTGATTCCTGATGTC-3’ | 23 | |
| CPT1琢 | F：5’-AGGACCCTGAGGCATCTATT-3’ | 20 |
| R：ATGACCTCCTGGCATTCTCC-3’ | 20 | |
| GAPDH | F：5’-TGAAGCAGGCATCTGAGGG-3’ | 19 |
| R：5’-CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG-3’ | 20 |
采用SPSS 19.0软件处理数据，数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）方法；两组间比较，满足方差齐性时用LSD检验，不满足方差齐性时用非参数检验；P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示差异有统计学意义。
3 结果 3.1 一般情况结果喂养4周后，正常组小鼠精神良好，反应灵敏，动作灵活，皮毛光泽。模型组小鼠经高脂饲料喂养后，体质量较正常组显著增高（P＜0.01），见表 1；并出现多饮、多尿、多食、皮毛无光泽，异槲皮苷组表现较模型组改善。
3.2 异槲皮苷对db/db小鼠体质量、空腹血糖、血脂的影响喂养4周后，模型组小鼠体质量、血清FBG、CHO、TG、FFA水平较之正常组显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，异槲皮苷组血清体质量、FBG、CHO、TG、FFA水平显著降低（P＜0.05）。见表 2。
| 组别 | 动物数 | 体质量（g） | FBG（mmol/L） | CHO（mmol/L） | TG（mmol/L） | FFA（mmol/L） |
| 正常组 | 6 | 26.72±1.08 | 4.70±0.52 | 1.80±0.24 | 0.62±0.13 | 0.40±0.01 |
| 模型组 | 6 | 35.90±2.13** | 25.73±2.67** | 2.23±0.26* | 1.30±0.19** | 0.53±0.06# |
| 异槲皮苷组 | 6 | 32.60±1.62# | 19.42±2.15## | 1.88±0.22# | 0.96±0.17# | 0.43±0.05* |
| 注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 | ||||||
实验4周后，模型组小鼠肝质量、肝质量/体质量明显高于正常组小鼠（P＜0.01）；而异槲皮苷组肝质量、肝质量/体质量较模型组小鼠显著改善（P＜0.05或P＜0.01）。见表 3。
| 组别 | 动物数 | 肝质量/体质量 | 肝质量（g） |
| 正常组 | 6 | 0.032±0.002 | 0.85±0.03 |
| 模型组 | 6 | 0.042±0.004** | 1.51±0.07** |
| 异槲皮苷组 | 6 | 0.038±0.001# | 1.24±0.03## |
| 注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05, ##P＜0.01。 | |||
光镜下观察，正常组小鼠肝组织以中央静脉为中心肝细胞呈放射状，排列整齐，细胞形态正常，核圆、居中、质均，无脂肪变性；模型组可见大量肝细胞体积膨大、且排列散乱，胞浆淡染或透明出现大量脂肪空泡，呈现脂肪样变特征，胞核被挤于细胞一侧，可见炎细胞浸润；异槲皮苷组较之模型组肝细胞脂肪样变程度较轻，胞内脂滴少，胞浆染色较深，细胞排列尚可。
3.5 异槲皮苷对db/db小鼠肝脏SREBP1c、FAS、沉默信息因子1（Sirt1）、过氧化物酶增殖物激活受体γ辅助激活因子（PGC1α）、过氧化物增殖物激活受体α（PPARα）、肉毒碱棕榈酰基转移酶1α（CPT1α）mRNA表达的影响4周后，模型组胆固醇应答元件结合蛋白1c（SREBP1c）、脂肪酸合成酶（FAS）mRNA表达与正常组比较显著增加（P＜0.05），而PGC1α、PPARαmRNA表达显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，异槲皮苷组小鼠肝组织中SREBP1c、FAS mRNA表达水平显著降低（P＜0.01），PGC1α、PPARαmRNA表达显著升高（P＜0.05）。见表 4。
| 组别 | 动物数 | SREBP1c | FAS | Sirt1 | PGC1α | PPARα | CPT1α |
| 正常组 | 6 | 0.86±0.22 | 0.93±0.56 | 1.45±0.91 | 1.23±0.42 | 1.60±0.59 | 1.26±0.46 |
| 模型组 | 6 | 2.07±0.92* | 1.78±0.51* | 1.29±0.57 | 0.52±0.27** | 0.81±0.55* | 1.09±0.34 |
| 异槲皮苷组 | 6 | 1.00±0.56# | 0.57±0.17## | 1.57±0.20 | 1.19±0.53# | 1.58±0.47# | 1.20±0.18 |
| 注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 | |||||||
2型糖尿病是一种慢性代谢性疾病，常伴脂肪酸代谢紊乱，如脂肪酸合成氧化的异常、脂质在细胞内的异常蓄积等，这些都与2型糖尿病及胰岛素抵抗的发生密切相关[6-7]。研究表明，升高的游离脂肪酸不仅可以抑制肝和外周组织对胰岛素的敏感性、刺激糖异生[8]；还通过促进炎症因子释放，如TNF-α、IL-6，加重胰岛素抵抗[9]。肝脏是人体糖、脂肪代谢的主要场所，与2型糖尿病糖脂代谢紊乱密切相关。本研究中发现异槲皮苷显著降低自发性糖尿病模型db/db小鼠体质量、血清FBG、TG、CHO、FFA水平，并且改善肝细胞中脂质的蓄积，减轻肝细胞脂肪变性；与既往研究中异槲皮苷降低肝细胞脂质沉积结果相一致[5]。
SREBP1c是脂肪酸合成基因的重要转录调节因子之一，主要分布在脂肪酸代谢旺盛的肝脏、脂肪等组织[10]；脂肪酸合成酶（FAS）是内源性脂肪酸合成中的关键酶，通过催化乙酰CoA和丙二酰CoA，参与长链脂肪酸的生成[11]。研究发现，SREBP1-/-肥胖小鼠较正常小鼠肝脏脂肪含量减少，脂肪酸水平降低[12-13]。本研究中异槲皮苷组小鼠SREBP1c、FAS mRNA表达较模型组显著降低，说明异槲皮苷抑制脂肪酸合成过程中关键酶及其转录调控因子的基因表达。
Sirt1、过氧化物酶增殖物激活受体γ辅助激活因子1α（PGC1α）、过氧化物增殖物激活受体α（PPARα）、肉毒碱棕榈酰基转移酶1α(CPT1α)是调节肝脏脂肪酸氧化的重要因子。Sirt1是重要的能量稳态调控因子，一方面通过去乙酰化作用激活PGC1α调节饥饿状态下脂肪代谢[14]，另一方面能够诱导AMPK磷酸化调控线粒体脂肪酸β氧化参与脂肪酸代谢[15]。PPARα被称作“脂肪酸感受器”，通过增加细胞表面脂肪酸转移酶、CPT1α、脂肪酸转运蛋白、肝脏型脂肪酸结合蛋白等脂肪酸β氧化过程关键酶和蛋白的表达，促进脂肪酸向细胞内转移参与β氧化[16]；此外PPARα还与PGC1α协同作用加强脂肪酸氧化和减少脂质沉积[17]。本研究中，异槲皮苷组小鼠肝脏PGC1α、PPARαmRNA的表达较模型组显著增强，而Sirt1、CPT1αmRNA表达也呈现增强趋势，提示异槲皮苷上调脂肪酸氧化过程中关键因子的基因表达，起到促进脂肪酸氧化的作用。
综上所述，异槲皮苷改善自发性糖尿病模型db/db小鼠体质量、脂肪酸代谢紊乱和肝脏脂肪蓄积，可能与其调控肝脏脂肪酸代谢过程中细胞因子、关键酶及其转录调控因子的基因表达相关，为进一步研究其作用机制提供实验基础。
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2. Institute of Health cultivation, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;
3. Department of Geriatrics, The First Affiliated Hospital of Shaanxi University of traditional Chinese Medicine, Xianyang 712000, China;
4. Medical College of Hebei University of Engineering, Handan 056000, China