慢性再生障碍性贫血是一种由多种病因引起的骨髓造血功能衰竭，临床上呈全血细胞减少的难治性血液病^[1]。端粒酶参与造血干细胞的生成分化过程，而慢性再生障碍性贫血中端粒酶突变阻碍造血干细胞的生成分化，导致造血能力下降，且端粒酶活性在代偿机制下升高^[2-3]。中医学中慢性再生障碍性贫血与“虚劳”、“髓枯”类似^[4]，临床多数认为肾虚是其主要发病机制，运用补肾法治疗慢性再生障碍性贫血。近年来，本课题组以补肾调和肝脾法为主要原则治疗慢性再生障碍性贫血的研究取得了令人满意的成绩^[5]。为进一步探讨其作用机制，笔者在常规西药（司坦唑醇）基础上，配合以“补肾调和肝脾”为治则的黑逍遥散加减方治疗慢性再生障碍性贫血，评价临床疗效及不良反应，并分别于治疗前后采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测外周血单个核细胞端粒酶表达水平。将结果报道如下。

1 资料与方法 1.1 一般资料

92例2014年6月—2016年6月潍坊医学院附属医院慢性再生障碍性贫血住院患者。采用随机数字表法随机分为治疗组和对照组，各46例。治疗组男25例，女21例；年龄7~68岁，平均年龄（35.26±17.04）岁；病程0.6~220个月，平均病程（62.08±56.88）个月。对照组男24例，女22例；年龄9~66岁，平均年龄（35.89±15.74）岁；病程0.7~210个月，平均病程（61.88±56.24）个月。两组患者在性别、年龄、病程比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 诊断标准

西医学诊断标准参照张之南主编《血液病诊断及疗效标准》（第3版）^[6]制定，中医证候诊断标准参照邓成珊、周霭祥主编《当代中西医结合血液病学》^[7]和2002年《中药新药临床研究指导原则（试用）》^[8]制定。

1.3 纳入标准

患者符合以上西医和中医诊断标准；年龄6~70岁；签署知情同意书；坚持治疗者。

1.4 排除标准

孕妇患者；病情危笃的晚期患者；同时合并其他疾病者，如阵发性睡眠性血红蛋白尿、急慢性白血病、骨髓增生异常综合征等；治疗过程中转化为上述诸病症者；已接受环孢菌素A、抗胸腺细胞球蛋白、抗淋巴细胞球蛋白等免疫抑制剂治疗者；不愿合作者。

2 治疗与观察方法 2.1 治疗方法

对照组：用司坦唑醇（康力龙）治疗：司坦唑醇片，每次2~4 mg，口服，每日3次。治疗组：在对照组治疗的基础上口服黑逍遥散加减方，方药组成：柴胡9 g，茯苓9 g，白术9 g，当归6 g，白芍6 g，生姜3 g，大枣5 g，炙甘草3 g，熟地黄10 g，山茱萸10 g，补骨脂10 g，枸杞子10 g。常规煎法，每日1剂，分2次口服，儿童根据体质量酌情减量。2组均以3个月为1个疗程，6个月后观察相关结果。如合并感染、发热者，用经验性抗生素抗感染；血红蛋白（HGB）低于60 g/L者，酌情输注浓缩红细胞；出血倾向明显，血小板计数（PLT）低于20×10⁹/L者，可酌情输注浓缩血小板和止血治疗。

2.2 安全性评价

包括生命体征检测；血、尿、便常规；心、肝、肾功能检查；心电图等检查。

2.3 观察指标

外周血常规[HGB、白细胞（WBC）、PLT]；TERT mRNA表达水平。

2.4 疗效标准

参照张之南主编《血液病诊断及疗效标准》（第3版）^[6]中慢性再生障碍性贫血疗效判定标准判定。基本治愈：贫血和出血症状消失，HGB达到120 g/L（男），或110 g/L（女），WBC达到4.0×10⁹/L，血小板达到100×10⁹/L，随访1年以上无复发者。缓解：贫血和出血症状消失，HGB达到120 g/L（男），100 g/L（女），WBC达到3.5×10⁹/L，血小板也有一定程度增长，随访3个月病情稳定或继续进步者。明显进步：贫血和出血症状明显好转，不输血，HGB较治疗前1个月增长30 g/L以上，并能维持3个月以上者。无效：症状、血常规无明显进步。判定以上疗效时，均应3个月内不输血。

2.5 外周血单个核细胞端粒酶活性检测采用RT-PCR方法 2.5.1 主要试剂和相关配液

人淋巴细胞分离液由索莱宝公司提供。RNA提取试剂盒购于索莱宝公司，RT-PCR逆转录反应试剂盒购于东洋纺（上海）生物科技有限公司，端粒酶活性实时荧光定量PCR法检测试剂盒购于江苏凯基生物技术股份有限公司。

2.5.2 实验方法

取2 mL新鲜抗凝全血，用等体积的PBS稀释全血。在15 mL离心管加入4 mL分离液，将稀释后的血液平铺于分离液上方，保持两液面界面清晰。室温下，离心30 min。离心后将出现明显的分层，血浆与分离液之间的白膜即为淋巴细胞。将淋巴细胞小心吸出放入到新的离心管内，加入10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并离心。弃上清液，5 mL PBS洗涤细胞，离心。弃上清液，将淋巴细胞重悬备用。按照RNA提取试剂盒说明提取总的RNA，按逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA。最后按照端粒酶活性实时荧光定量PCR法检测试剂盒的要求，将反应体系设为25 μL，反应条件为：95 ℃总变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃复性30 s；72 ℃延伸30 s，共40个循环。PCR扩增仪（Bio-Rad公司）进行实时荧光定量分析，检测慢性再生障碍性贫血患者外周血单个核细胞端粒酶逆转录酶TERT mRNA的表达水平。

2.6 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。计量资料进行正态性检验，计量资料的描述采用均数±标准差（x±s）表示；两组临床疗效比较采用Wilcoxon秩和检验；治疗前后指标比较采用配对t检验；治疗组与对照组间比较采用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 两组患者临床疗效比较

疗效的秩次顺序按照无效到治愈排列，从治疗组和对照组的平均秩次来看，显然治疗组的平均秩次较高，治疗组的疗效优于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。

3.2 两组患者治疗前后外周血象原始指标比较

在治疗组中，治疗后外周血象WBC、HGB、PLT与治疗前相比均明显改善，差异有统计学意义（P＜0.01）；在对照组中，治疗后外周血象WBC、HGB、PLT与治疗前相比均明显改善, 差异有统计学意义（P＜0.05）；两种治疗方法均可改善外周血象WBC、HGB、PLT。见表 2。

3.3 两组患者各指标治疗前后的指标差值变化比较

两组患者治疗前后WBC差值变化不具有统计学意义（P＞0.05），两组患者治疗前后HGB、PLT的差值变化具有统计学意义（P＜0.01），且治疗组在改善HGB、PLT方面优于对照组。见表 3。

3.4 两组治疗前后TERT mRNA表达水平及差值比较

在治疗组中，治疗前后TERT mRNA表达水平具有统计学差异（P＜0.01）；在对照组中，治疗前后TERT mRNA表达水平具有统计学差异（P＜0.01）；两组患者治疗后TERT mRNA表达水平差异具有统计学意义（P＜0.01），且治疗组较对照组TERT mRNA表达水平明显降低。见表 4。

3.5 不良反应

对照组有1例出现谷丙转氨酶升高，3例出现不同程度的多毛、痤疮等。治疗组未见谷丙转氨酶升高，仅有1例出现轻度多毛、痤疮，经治疗后好转。

4 讨论

慢性再生障碍性贫血发病机制为骨髓造血干祖细胞缺陷，造血微环境改变和免疫功能异常。近年研究显示，正常人端粒酶活性处于低表达状态，而再生障碍性贫血患者和正常人相比，端粒酶活性增高^[9-10]。端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，最近研究发现，端粒酶参与基因的表达调控、细胞增殖和凋亡^[11-12]。Wang XG的研究显示，再生障碍性贫血患儿骨髓造血干细胞端粒酶活性明显增高，端粒酶活性的表达可能参与了再障的病理生理和发展过程^[13]。周玉洁^[14]认为，再障患儿造血干细胞端粒酶和Htert mRNA的表达水平升高，其发病及发展与端粒酶活性的变化有关。Chatterjee S文献分析，再生障碍性贫血存在端粒酶突变，影响细胞凋亡、衰老等生理过程^[15]。Allegra A^[16]认为，端粒酶突变是某些血液肿瘤发生的遗传危险因素，端粒和端粒酶在抗癌治疗中具有靶向性。Burchett KM^[17]的研究显示，端粒酶抑制剂可以限制胰腺癌细胞的寿命。抑制端粒酶的研究已经证实，抑制端粒酶逆转录酶可导致渐进性的端粒缩短，最终导致癌细胞死亡^[18]。端粒酶蛋白催化亚基（TERT或TRT）具有反转录酶的主要特征，其表达在正常细胞中受到抑制，研究表明TERT或TRT的表达与端粒酶活性的表达一致。深入了解端粒酶的表达变化不仅为慢性再生障碍性贫血提供新的生物标志物和早期检测指标，而且为疾病的预后判断和治疗的发展提供依据。

中医学认为，慢性再生障碍性贫血的主要病机在于“肾虚髓亏”，“补肾”是其根本的治则^[19]。课题组在临床研究中发现“肝郁脾虚证”同样是慢性再生障碍性贫血的重要证候，由于慢性再生障碍性贫血具有病程长，病情反复，影响生活质量等特点，患者的精神压力比较大，肝气郁结，疏泄失职，肝木旺盛而乘脾土之象多见。肝藏血，体阴而用阳，需要气血的濡养，肝失疏泄则影响脾胃运化而致脾虚；脾有生成气血的功能，脾气虚弱，运化无力则气血亏虚，可致肝体失养。“补肾调和肝脾法”同样是慢性再生障碍性贫血重要的治疗方法，基于慢性再生障碍性贫血患者“肾精不足为本，肝脾失和并见”的病机特点，临床中，笔者创新地运用“补肾调和肝脾法”治疗慢性再生障碍性贫血，取方黑逍遥散加减。方中柴胡归肝、胆经，性善条达舒畅肝气，疏肝解郁，则气血调畅，脏腑安定；当归、白芍同属肝经，养血柔肝，涵养肝气，使之冲和条达；茯苓、白术味甘，益气健脾渗湿，使气血充盛；枸杞子、补骨脂、熟地黄、山茱萸肝肾同补，益精充髓，阴中求阳，阳中求阴；生姜、大枣、炙甘草补脾益气。该方补法和法并用，具有补肾益髓，疏肝养血，健脾益气之功，取得了良好的临床疗效^[5]。

综上所述，通过检测端粒酶逆转录酶mRNA的表达水平来反应端粒酶的活性，用端粒酶活性的变化来评价补肾调和肝脾法对再生障碍性贫血患者的疗效，发现补肾调和肝脾法能显著改善慢性再生障碍性贫血患者外周血象，降低外周血单个核细胞端粒酶的活性。因此，笔者认为补肾调和肝脾法治疗慢性再生障碍性贫血疗效确切，其作用机制可能与降低外周血单个核细胞端粒酶活性, 参与造血干细胞的生成分化有关。本试验为深入研究慢性再生障碍性贫血的病因病机，完善再障治法提供了分子学依据。