咳喘六味合剂为上海龙华医院院内制剂，是上海市名中医吴银根教授根据多年临床经验，遵循哮病“阳虚寒盛”之病机，在麻黄附子细辛汤的基础上精心化裁成方，在治疗寒性咳喘方面具有确实的临床疗效^[1-4]。

前期实验对咳喘六味合剂影响以下指标进行了实验动物研究，包括：嗜酸性粒细胞数、低密度嗜酸性粒细胞百分比、白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）、可溶性细胞间黏附分子-1（sICAM-1）、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）以及外周血白细胞糖皮质激素受体（GR）^[5-10]等。研究结果表明咳喘六味合剂通过干预炎症反应治疗哮喘。

基因表达分析在基因芯片技术中应用最为广泛。基因芯片高通量的特性使它能在短时间内测定大量基因的差异表达，这与传统方法每次只能研究一个基因的表达非常不同，从而大大提高对相关基因研究的效率^[11]。

本研究欲通过基因芯片技术对药物作用后寒哮患者外周血RNA表达谱进行分析，发现药物作用的基因靶点和可能的作用通路，尝试对药物作用进行基因层面的机制研究。

1 材料与方法 1.1 临床资料

根据中华医学会呼吸病学分会哮喘学组2013年“支气管哮喘防治指南”^[12]制定的治疗前哮喘诊断标准、哮喘严重程度分级标准及2002年临床试验研究国家药品监督管理局《中药新药临床研究指导原则》^[13]制定的中医证候(寒哮) 诊断标准, 选取2014年9月-2015年5月上海中医药大学附属龙华医院呼吸科门诊就诊的哮喘急性发作期寒哮患者16例，随机分为2组，咳喘六味合剂观察组8例，平均年龄（42.38±10.45）岁，安慰剂组8例，平均年龄（44.53±11.02）岁。性别、年龄经统计学分析差异无统计学意义。

1.2 病例纳入标准

符合支气管哮喘诊断标准及中医证候诊断标准，属于轻、中度哮喘发作期患者，年龄在18~75岁之间的门诊患者，并能接受治疗、观察和各项检查，提交书面知情同意书者。

1.3 排除标准

合并有严重心、肝、肾、造血系统和内分泌系统等原发性疾病，或肿瘤、艾滋病、精神病患者；妊娠或哺乳期妇女；未按规定用药，无法判断疗效或资料不全等影响疗效判断者。

1.4 治疗方案

中药咳喘六味合剂组：口服咳喘六味合剂每次20 mL，每日3次。安慰剂对照组：口服空白对照口服液，用法用量同治疗组。疗程为1周。本实验经上海中医药大学附属龙华医院临床研究伦理委员会的批准后执行。中药咳喘六味合剂和安慰剂均由上海中医药大学附属龙华医院生产监制。

1.5 实验方法 1.5.1 总RNA提取和纯化

分别抽取两组患者服药1周后外周血作为检测样本，所有受试者空腹10 h，抽取清晨静脉血标本2 mL，注入Paxgene管混匀，置于-80 ℃冰箱保存待用。用QIAGEN Rneasy Kit（Invitrogen公司，美国）提取纯化样本总RNA后，Nano Drop测得RNA浓度和260/280。

1.5.2 cDNA、cRNA的合成和标记

按照安捷伦公司提供的安捷伦单色RNA Spike-In试剂盒操作步骤，严格按说明书进行。合成cDNA，以含PolyT的cDNA单链为模板链使用Low Input Quick Amp Labeling Kit试剂盒，以生物素Cy3标记的核糖核苷酸为原料合成生物素标记cRNA，用QIAGEN Rneasy Kit进一步纯化cRNA。以NANO紫外分光光度仪检测标记后的cRNA的浓度、纯度。

1.5.3 cRNA样品片段化及芯片杂交

提取用Cy3标记好的cRNA 1 650 ng，加入Bloocking Agent 11 μL，Fragmentation Buffer 2.2 μL，最后加入Nuclease-free水至总体积到55 μL，将上述配置好的混合液加热至60 ℃温浴30 min进行片段化；然后向片段化溶液中加入GEXHy bridization Buffer 55 μL最后加上述溶液100 μL于芯片（Human GE 4×44K V2 Microarray Kit，Agilent公司，美国）上，然后在65 ℃，17 h，10 r/min滚动杂交。取出芯片于洗液1中洗涤1 min，然后再将芯片放入洗液2中于37 ℃洗涤1 min，晾干。

1.5.4 芯片扫描和数据处理

芯片杂交结果采用Agilent G2565AA荧光扫描仪进行扫描，Feature Extraction软件读取，结果采用Feature Extraction进行均一化处理。

1.5.5 生物信息学分析

用Gene Ontology（GO）功能分类标准对差异基因进行功能分类分析、用Pathway分析对差异表达基因进行生物信号通路分析。

2 结果 2.1 RNA浓度、质检结果

见表 1。

2.2 表达差异基因筛选

原始数据用软件Gene Spring Software归一化后，采用Fold-change（表达差异倍数）以及t检验（Student’s t-test）统计学方法对差异基因进行筛选，挑选条件如下：1) Fold Change（linear）≤2/3或者Fold Change（linear）≥1.5。2）t-test p-value < 0.05。从26 083条表达基因谱中，筛选差异表达1.5倍或-1.5倍以上的基因，对这些基因进行聚类分析，并用GO及Pathway功能进行分类分析。筛选出药物及安慰剂作用后两组差异表达1.5倍以上的基因有233条，其中上调基因106条，下调基因127条。

2.3 差异表达基因的GO分析

根据结果中每一靶基因功能的显著性水平，构建显著性靶基因功能的分布图，纵坐标为靶基因功能名称，横坐标为P值的负对数（其值越大表明P值越小，即该靶基因功能显著性水平越高）。P值与差异表达的基因数目、注释为特定基因功能的差异表达基因数目相关。以P值小于0.05进行筛选，得到靶基因参与的显著性的基因功能有45条。

通过GO分析，发现差异表达基因集中在细胞外基质（分子功能）、炎性反应（生物过程）、免疫调节（生物过程）、蛋白连接（分子功能）、血管生成调节（生物过程）、肿瘤坏死因子（生物过程）、细胞骨架（生物过程）、肌纤维（细胞组成）、巨噬细胞分化（生物过程）、转化生长因子（分子功能）等相关功能区。

2.4 差异表达基因的Pathway分析

根据KEGG数据库，利用DAVID数据库的注释功能对差异性的表达基因进行注释，对靶基因整合后进行显著性Pathway分析，以P值小于0.05进行筛选，得到靶基因参与的显著性的Pathway有20条项。

通过Pathway分析差异表达的基因主要涉及细胞因子和受体相互作用、黏着斑、钙信号通路、血管平滑肌收缩、MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路、趋化因子、糖降解、酪氨酸代谢、细胞外基质受体、蛋白质消化吸收等相关信号通路。其中黏着斑、钙信号通路、MAPK信号通路在哮喘研究过程中受到越来越多的重视^[14-16]。

2.5 咳喘六味合剂治疗寒哮型支气管哮喘的可能作用靶点及生物学通路

通过两个数据库富集结果、相关条目显著性、条目中所包含的差异基因数目、相关基因的差异倍数，选取以下与哮喘相关的基因功能条目和信号通路以及其中包含的差异表达基因作为咳喘六味合剂治疗寒哮可能的途径和靶点：咳喘六味合剂治疗寒性哮喘导致差异表达的基因集中在免疫、炎症、血管生成负调节、肿瘤坏死因子受体连接功能区。见表 2。细胞因子-受体相互作用、黏着斑、钙信号、细胞外基质受体相互作用等生物学通路。见表 3。

3 讨论

咳喘六味合剂方以附子、麻黄为君，两味辛温大热的君药既能够温肾补火，又能温肺散寒、宣肺平喘。细辛辛温香窜的特性使其不仅能够助麻黄散外寒，还能助附子祛里寒。痰瘀是哮喘的宿根，可以通过桃仁祛瘀化痰得以解除，故桃仁与细辛共同为臣药；虎耳草和黄芩的苦寒作用，一方面清肺化痰，另一方面制约温热药物辛燥作用，同时还能预防本质之寒郁而化热。有现代药理研究证实，方中诸药具有解痉平喘、调节机体免疫、抗病毒作用^[17-18]。

前期关于咳喘六味合剂的研究中选取的各项指标，多为气道炎症相关指标，如嗜酸性粒细胞数、低密度嗜酸性粒细胞百分比、IL-4、IL-5、sICAM-1、ECP等，提示咳喘六味合剂是通过影响与气道变应性炎症相关的细胞、细胞因子、黏附分子治疗哮喘^[19]。但哮喘作为一种复杂的、多因素参与的疾病，涉及多机制多通路，其中免疫与变态反应、气道炎症、气道高反应、气道重塑的研究较为集中，神经-受体调节、基因遗传、离子通道对以上机制进行了补充^[20]。本次研究通过基因芯片技术观察咳喘六味合剂治疗哮喘作用途径，发现药物作用后影响到的相关基因表达，不仅涉及免疫反应、炎症反应，还与气道重塑、钙离子通道等功能相关，表明咳喘六味合剂治疗哮喘的多靶点、多途径特点。

钙离子通道与哮喘的相关性主要体现在调节支气管平滑肌收缩、气道重塑、炎症介质释放等方面^[21]。通过开放钙离子通道提高细胞内钙浓度，从而实现支气管平滑肌的收缩。另外钙离子是重要的第二信使，通过对炎症介质和细胞因子的释放调节细胞功能。

MAPK通路对哮喘的影响表现在该通路能够使哮喘患者体内的胞浆型磷脂酶A2（cPLA2）磷酸化并被激活^[22]。cPLA2是多种炎性介质生成的限速酶，在哮喘发病中起着重要作用。该通路还能够促进转录因子磷酸化、参与激素抵抗型哮喘、促进胞浆蛋白磷酸化产生白三烯、影响细胞增殖^[23]，导致哮喘发作。

中医学是通过整体观、辨证观来认识疾病的。这与基因芯片技术高通量和平行检测的特点有一定相似之处。而且研究基因组的整体变化比研究单个基因变化更能反应真实状态下的生命活动，这与中医学的整体观又是极其一致的。通过基因芯片技术高效快速地进行大量的基因表达检测，可以为中医药发挥治疗作用的机制研究提供大量生物学信息^[24-25]。

本次研究利用基因芯片技术，通过基因表达谱差异分析发现咳喘六味合剂治疗寒性哮喘可能与上述途径及基因相关，研究结果为日后开展咳喘六味合剂治疗寒哮的作用机制研究提供了全新的思路和广阔的前景。组方中何种药物何种成分发挥了相应作用以及具体的作用途径及机制，尚需要进一步探索。