冠心病是由于冠状动脉狭窄导致心肌血氧供应不足而引发的一类以“胸闷、胸痛、心悸、气短”为主要症状，同时还伴有心电活动和心律改变的心脏疾病。冠心病根据其临床表现可归于中医学的胸痹、心痛范畴。对于其发病机制历代医家有相似的认识，常因饮食不节、过食肥厚、损伤脾胃、内生痰浊、痰浊阻滞、滞血成瘀、壅阻心脉；或因年老久病，脏腑功能虚损；或正气亏虚，气虚血瘀，痹阻胸中，胸阳不振，痰浊内生，痰瘀痹阻心脉而发病。由此可见痰浊﹑血瘀﹑痰瘀互结为导致胸痹心痛主要病因^[1]。冠心病患者按中医辨证虽然分为心血瘀阻、气滞心胸、痰浊闭阻、气阴两虚、心肾阴虚、心肾阳虚、寒凝心脉7个证型，但有研究者通过对全国范围的冠心病中医临床流行病学的调查发现冠心病本虚以气虚、阴虚为主，标实以血瘀、痰浊、气滞多见，血瘀、痰浊等标实证候要素及相关的证候类型近年来所占比例在不断增加，并且痰瘀互结证最为常见^[2-4]。本实验旨在通过高脂饲料喂养结合异丙肾上腺素诱导建立冠心病痰瘀互结证小鼠模型，探讨冠心病痰瘀互结证小鼠模型的初步形成机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物

选用6周龄雌、雄各半的C57BL/6J小鼠，6周龄雌、雄各半的ApoE基因敲除小鼠，体质量18~22 g，饲养于SPF级环境内，分笼饲养。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2012-0001。

1.2 试剂与仪器

高脂饲料（江苏美迪森生物医药有限公司提供，MD12015）。异丙肾上腺素（Sigma公司，货号I5627-5G）、TM-100型医用超声耦合剂、生理盐水。Vevo2100小动物超声实时影仪器（加拿大VisualSonics公司）、多功能酶标仪（美国Perkin Elmer公司）等。

2 实验方法 2.1 分组及造模方法

小鼠分为空白组：10只C57BL/6J小鼠，喂养普通饲料6周；模型组：10只ApoE基因敲除小鼠，喂养高脂饲料6周，并于小鼠处死前7 d每日按照0.02 mL/g的量进行皮下注射异丙肾上腺素（10 mg/kg），空白组给予等量的生理盐水。

2.2 模型评价方法 2.2.1 一般状态

第0周、第6周末分别称取小鼠体质量，第6周末观察小鼠活动度、厌食情况、下肢有无水肿、二便情况。

2.2.2 小动物超声评价左心室功能变化

第6周末次皮下注射异丙肾上腺素15 min后，小鼠使用三溴乙醇麻醉后，用胶带将小鼠腹部向上固定于操作台，设置温度为37 ℃，剔除颈部及前胸毛，暴露前胸壁，均匀涂抹一层TM-100型医用超声耦合剂，采用Vevo2100超高分辨率小动物超声实时影像仪检测小鼠左心室结构及形态变化。所有数据均在实验结束后，采用超声系统自带软件进行分析^[5]。

2.2.3 检测小鼠血脂水平

第6周末，各组小鼠检测小动物超声后，眼眶取血，3 500转离心15 min，分离血清，采用试剂盒检测血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的含量。

2.3 统计学方法

应用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较使用单因素方差分析（One-Way ANOVA），以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 各组一般状态比较

各组第6周体质量均比第0周显著增加，符合小鼠正常生长规律，有统计学意义（P < 0.01）。见表 1。第6周末，痰瘀互结模型组出现了厌食情况，由于喂养高脂饲料，大便呈绿色，活动度有所减少。空白组进食量均有所增加。各组均未出现下肢水肿。

3.2 各组小动物超声检查结果比较

与空白组比较，痰瘀互结模型组舒张末期室间隔厚度（IVSd）、收缩末期室间隔厚度（IVSs）、舒张末期左心室后壁厚度（LVPWd）、收缩末期左室后壁厚度（LVPWs）均明显增厚（P < 0.01），呈心腔扩大的心肌肥厚特征，左室质量（LVM）明显增大，具有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。雌鼠和雄鼠的检测结果具有一致性。见表 2。

3.3 各组小鼠血脂水平比较

实验第6周末，与空白组比较，痰瘀互结模型组雌雄小鼠的TC、TG、LDL-C均明显升高，具有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表 3。

4 讨论

冠心病痰瘀互结证的发病与动脉粥样硬化关系密切。动脉粥样硬化的发生机制是血浆中脂质沉积在动脉内膜并刺激结缔组织增生。近年来国内外研究者越发认识到冠心病痰瘀互结证的动物实验研究应从易患危险因素高脂血症着手，在此基础上，进行药物法或手术法诱发冠状动脉狭窄及梗死^[6-7]。因此，在建立冠心病痰瘀互结证模型之前，首先应建立高脂血症模型，而喂养高脂饮食是建立大多数动脉粥样硬化模型的重要方法^[8]。传统的冠心病痰瘀互结证模型主要包括两大类：1）给予小型猪高脂饮食复合微创介入技术，至球囊损伤左冠状动脉前降支造模法^[9]；2）给予大鼠高脂饮食并进行冠状动脉左前降支结扎造模法^[10-12]。上述两类方法实验周期较长，实验操作难度较大，对大鼠实施冠状动脉左前降支结扎会不同程度增加实验动物的死亡率，提高实验成本。因此，本研究希望能够利用近年来研究者们比较认可的ApoE基因敲除小鼠通过高脂饲料喂养结合药物诱导的方法，建立死亡率低，且稳定性和重复性好，操作简便的冠心病痰瘀互结证模型。

本研究中ApoE基因敲除小鼠通过高脂饲料喂养，过食肥甘厚味，脾胃失健，聚湿成痰，在此基础上，结合药物诱导，模拟冠心病痰瘀互结状态。小鼠一般状态观察结果表明相同周龄时，雌鼠的体质量比雄鼠的体质量稍低，而每组的小鼠体质量的6周增长量基本一致，但在模型评价过程中小动物超声检测时雄鼠体质量相对较大，麻醉剂的使用剂量更易控制。小鼠血脂水平的检测中，比较雌、雄小鼠检测结果发现，雄鼠TC水平升高的更为显著，而雌鼠TG水平升高的更为显著，推测这可能与雌鼠体内的雌激素对血脂水平有一定的影响相关。给予ApoE基因敲除小鼠高脂饮食与普通小鼠比较更易形成痰浊的状态，可以相对缩短造模时间，同时给予ApoE基因敲除小鼠长时间小剂量注射异丙肾上腺素，结果表明痰瘀互结模型组小鼠IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs均明显增厚，呈心腔扩大的心肌肥厚特征，同时LVM明显增大，从而模拟中医血瘀的状态^[13-16]。

本研究结果表明冠心病痰瘀互结证小鼠模型不会增加小鼠的死亡率，且稳定性好，但冠心病痰瘀互结证属于兼夹证候，相对复杂，并且课题组冠心病痰瘀互结证小鼠模型的建立仍处于探索阶段，因此，本课题组后续会对此模型小鼠的心脏和主动脉病理形态学及相关炎症指标进行进一步的实验验证，以期建立与临床冠心病痰瘀互结证相似度高，能够较好地体现了病证结合模型创建理念，有利于长期观察及药物评价的冠心病痰瘀互结证小鼠模型。