环磷酰胺（Cy）是一种细胞毒性药物，能杀死进入循环周期或者有丝分裂的细胞，对正常组织细胞，特别是生长旺盛的淋巴细胞，损伤较大，阻断淋巴母细胞的生长发育，阻止T、B淋巴细胞的分化，抑制抗体的合成，造成免疫功能低下模型。

蒲黄为香蒲科（Typhaceae）植物水烛香蒲、东方香蒲或同属植物的干燥花粉，是一味具有止血、化瘀、通淋功效的常用中药。药理研究表明^[1-2]，蒲黄对血液系统、心血管系统、免疫系统都有一定的作用，临床上广泛应用于冠心病、心绞痛、高血压、高脂血症、妇科疾病等的治疗。但对于其提取物的免疫作用研究甚少，现对炒蒲黄与蒲黄炭提取物对环磷酰胺免疫抑制BALB/c小鼠非特异性免疫作用进行探讨，研究如下。

1 材料与方法 1.1 药物与试剂

蒲黄提取物（炒蒲黄提取物及蒲黄炭提取物），由天津中医药大学中医药研究院提取（炒蒲黄的出膏率为14.1%，蒲黄炭的出膏率为14.3%），使用前纯水稀释备用。环磷酰胺（江苏恒瑞医药有限公司，批号：12090625）：取环磷酰胺粉剂100 mg，生理盐水溶液加至10 mL，现配现用。中华墨汁（天津墨水厂，批号：Q/12NK5021）实验前以生理盐水1:5稀释；溶菌酶试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20130821）。

1.2 实验动物

清洁级BALB/c健康雄性小鼠117只，3周，体质量（20±2）g。饲养于天津中医药大学实验动物中心。适应性饲养1周，开始进行后续实验。

1.3 实验仪器

STAT FAX 2100全自动酶标仪（Awareness Technology Inc，USA）；电子分析天平（JA1003，上海天平仪器厂）。

2 实验方法 2.1 动物分组及模型的建立

健康BALB/c雄性小鼠，按体质量随机分为8组，包括空白对照组、模型组、炒蒲黄组（生药3.0、6.0、12.0 g/kg）、蒲黄炭组（生药3.0、6.0、12.0 g/kg）。预先灌胃15 d，第13天开始皮下注射环磷酰胺生理盐水溶液（浓度为每日100 mg/kg）制作免疫抑制动物模型，连续注射3 d，空白对照组给予同体积生理盐水。

2.2 小鼠体质量及部分器官测定

末次给药后禁食不禁水12 h以上。次日称质量记录，剥离胸腺、脾脏，分别称其质量并计算相应脏器指数。器脏指数=脏器质量（mg）/体质量（g）

2.3 碳粒廓清实验

取材当天，各组鼠尾静脉注射墨汁0.005 mL/g体质量，于1 min和5 min后，分别从眼眶静脉取血20 μL，加到2 mL 0.1%碳酸钠（Na₂CO₃）溶液中摇匀。用酶标仪测定680 nm处吸光值。分别用OD₁和OD₅来表示1 min和5 min所取血样的光密度。按下式计算廓清指数值和吞噬指数（及校正廓清指数）。

廓清指数K=（LogOD₁-LogOD₂）/（t₂-t₁）；吞噬指数α=体质量/（肝质量+脾质量）×K1/3

2.4 溶菌酶含量测定

取材当天，将各组小鼠直接进行眼眦部取血，血液在37 ℃放置30 min后，3 500 r/min离心15 min，取血清并于-20 ℃保存备用，参考溶菌酶试剂盒说明书操作。

2.5 统计方法

采用SPSS 18.0软件包分析，数据用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P < 0.05为差异具有统计学意义。

3 实验结果 3.1 对免疫抑制小鼠胸腺质量及指数的影响

注射环磷酰胺后，与空白对照组比较，模型组胸腺质量及胸腺指数显著降低（P＜0.01）。炒蒲黄、蒲黄炭组胸腺质量及指数呈剂量依赖性增加，同等剂量下，蒲黄炭生药3.0、6.0 g/kg较炒蒲黄有所增加，但与模型组比较，均无显著性差异。见表 1。

3.2 对免疫抑制小鼠脾脏质量及指数的影响

注射环磷酰胺后，与空白对照组比较，模型组脾脏质量及指数显著降低（P＜0.01）。炒蒲黄与蒲黄炭组脾脏质量及指数与模型组相比均显著升高（P＜0.01）。而同等剂量的蒲黄炭、炒蒲黄组之间脾脏质量及指数无统计学差异。见表 2。

3.3 对免疫抑制小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响

注射环磷酰胺后，与空白对照组比较，模型组廓清指数显著降低（P＜0.01）。蒲黄炭、炒蒲黄组廓清指数与模型组比较呈显著升高趋势（P＜0.01）。蒲黄炭组廓清指数呈剂量依赖性增加。同等剂量炒蒲黄与蒲黄炭之间廓清指数无差异。与空白对照组比较，模型组吞噬指数显著降低（P＜0.01）。炒蒲黄、蒲黄炭吞噬指数与模型组比较呈升高趋势，除炒蒲黄6.0 g/kg差异无统计学意义外（P＞0.05），其余剂量组均显著升高（P＜0.01）。同等剂量下，炒蒲黄、蒲黄炭组之间吞噬指数无统计学差异。见表 3。

3.4 对免疫抑制小鼠溶菌酶含量的影响

注射环磷酰胺后，与空白对照组比较，模型组溶菌酶含量降低（P＜0.05）。蒲黄炭组溶菌酶含量呈剂量依赖性增加。与模型组比较，炒蒲黄与蒲黄炭均能显著提高溶菌酶含量（P＜0.01）。蒲黄炭生药12.0 g/kg组与炒蒲黄组比较溶菌酶含量显著提高（P＜0.01）。见表 4。

4 讨论

非特异性免疫又称先天免疫或固有免疫。它和特异性免疫一样都是人类在漫长进化过程中获得的一种遗传特性。特异性免疫需要经历一个过程才能获得，而非特异性免疫是人一生下来就具有的，具有作用范围广，反应快，有相对稳定性、遗传性等特点。

蒲黄作为临床常用的一味中药，对心血管系统等方面的影响已被广泛认同，临床运用蒲黄不仅包括生蒲黄还包括炒蒲黄、蒲黄炭两种^[3-5]。炒蒲黄的炮制方法为200~220 ℃，固定14 r/min转速，而蒲黄炭的最佳炮制条件为140 ℃，烘制4 min 20 s^[6-8]。蒲黄的化学成分主要有甾类、黄酮类、氨基酸类、多糖类等，但经炒炭后极性小的化合物变化相对较小，极性大的化合物变化相对较大。黄酮类化合物在炒炭过程中不稳定，结构被破坏或转化导致蒲黄炒炭后黄酮类化合物含量显著降低。蒲黄炭总多糖减少，但炒蒲黄总多糖反而升高，这可能与蒲黄短时间加热，细胞壁破裂，多糖易溶出，而炒炭过程中受热温度较高，时间较长，多糖结构严重破坏相关。蒲黄炒炭后鞣质含量增加，黄酮类化合物转化成鞣质。化合物方面，蒲黄经炮制后，炒蒲黄异鼠李素-3-0-新橙皮糖苷和香蒲新苷含量降低，而在蒲黄炭中均已不能检出，这与蒲黄经炮制后总黄酮含量下降的趋势相一致^[9-12]。

本实验通过对免疫抑制的小鼠胸腺、脾脏的质量及相应脏器指数的测定，来分析炒蒲黄与蒲黄炭对于环磷酰胺免疫抑制小鼠的免疫功能的作用。从以上指标可知，炒蒲黄与蒲黄炭对环磷酰胺致小鼠免疫抑制有保护作用。两者均能增加小鼠的脾脏质量、指数以及提高溶菌酶含量，提高廓清、吞噬指数。由此得知，两者是通过提高免疫抑制小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能以及增加溶菌酶含量来改善小鼠免疫抑制作用的，且蒲黄炭能力优于炒蒲黄。这可能与蒲黄通过炮制后有效成分发生变化有关^[13]。

现代关于蒲黄的药理作用多趋向于活血化瘀、止血及高血脂的研究^[14-15]，但其对免疫作用的影响不容小觑，应该引起专家学者们的关注。本实验研究发现炒蒲黄及蒲黄炭对环磷酰胺免疫抑制BALB/c小鼠的部分非特异性免疫功能有一定程度改善作用，可以为以后开发免疫药物提供借鉴。