内质网应激在糖脂代谢过程中发挥重要的调节作用，内质网应激时可以激活未折叠蛋白反应（URP）^[1]，而肌醇必需酶1α（IRE1α）作为URP通路中最经典最保守的通路，应激程度在可控范围时，一方面它可以通过改善胰岛β细胞功能、促进胰岛β细胞增殖来促进胰岛素分泌而发挥降糖作用^[2]；另一方面也可以通过增IRE1α/XBP途径在脂肪肝脏从头合成和转运过程中发挥重要的作用^[3]，然而过度的应激会诱导细胞凋亡程序^[4]。糖尿病（DM）是一组由遗传和环境因素相互作用引起的体内胰岛素分泌缺乏和（或）其生物利用障碍所致的糖代谢紊乱，同时伴有脂肪、蛋白质、水、电解质等的代谢障碍，并以慢性高血糖为主要特征的代谢性疾病^[5]。随着人们的生活方式、饮食结构的显著改变以及老龄化社会进程的加速等，糖尿病、高脂血症的发病率正日益增长，中国糖尿病发病率日益增高，且伴有不同程度的高脂血症、脂肪肝，依据其病因病机及临床特点，应归属于“痰浊”等范畴。吴深涛教授经过多年临床探索及经验的总结，从中医浊毒与糖尿病血脂异常的相关性角度出发，提出了“由浊致毒”是糖尿病血脂异常中医病机的新理论，新认识。他认为浊有浊质, 毒有毒性。浊质黏腻导致浊邪为病，多易结滞脉络，阻塞气机，缠绵耗气，胶着不去而易酿毒性；而毒邪伤人，其性烈善变，损害气血营卫。两者相合则因毒借浊质，浊挟毒性，多直伤脏腑经络。该病变根源是脾失运化，升清降浊失司，化赤为血异常，导致浊邪内瘀血分，并渐由浊滋生毒性，形成初始阶段的“浊瘀血分”，持续阶段的“由浊致毒”，以及并发症阶段的“浊毒内伤”3个不同程度的病理演变过程^[6-7]。笔者在此理论的指导下，经过大量的临床观察发现，佩兰在调节糖脂代谢方面具有显著的疗效，故推测佩兰中药可能通过对IRE1α的调节干预发挥其调节糖脂代谢的作用，故通过本研究探讨IRE1α是否是佩兰中药颗粒的作用靶点之一。

1 实验材料与方法 1.1 实验动物及饲料

选择SPF级雄性Wistar大鼠，4~5周龄，体质量120~140 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，批号：SCXK（京）2014-0004。普通饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，高糖高脂饲料按照文献[8]配制，即普通饲料中加入20%的脂肪（50%猪油和50%蛋黄粉) 和20%蔗糖。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒购于北京鼎国生物有限责任公司，上海生工生物技术服务公司提供引物和内参，IRE1α兔多克隆抗体及羊抗兔二抗皆购自美国Santa Cruz公司。

1.2 药物及试剂

佩兰颗粒剂由四川新绿色药业科技发展有限公司提供（批号：1412038），实验用时用双蒸水配制成所需浓度溶液。链脲佐菌素（STZ）由美国Sigma公司提供。

1.3 实验动物与分组

选取6周龄雄性大鼠Wistar大鼠，适应性喂养1周，高脂饲料喂养10周后，按28 mg/kg的剂量一次性尾静脉注射（溶于0.1 mmol/L的柠檬酸缓冲液中pH4.5），以注射72 h后空腹血糖≥11.1 mmol/L，且随机血糖＞16.7 mmol/L作为成模标准。将造模成功的大鼠按随机数字表法随机分为模型组、吡格列酮组、佩兰中药组每组9只。空白对照组（10只）始终饲以正常饲料。

1.4 给药方法

依据临床疗效，中药佩兰用量0.5 g/（kg·d），故参照文献[9], 换算大鼠的灌胃剂量为3 g/（kg·d），吡格列酮组以0.3 mg/（kg·d）灌胃，空白对照组及模型组给予生理盐水。

1.5 血清采集及观察指标

治疗前于大鼠目内眦取血，治疗4周后于腹主动脉取血检测血糖、血清甘油三酯（TG）、血清总胆固醇（TC）、血清游离脂肪酸（FFA）水平。留取肝脏，以备后续RT-PCR、Western蛋白免疫印迹法检测。

1.6 RT-PCR检测

取50 mg肝脏组织，用Trizol试剂提取总RNA，用逆转录试剂盒说明进行操作，以GAPDH作为内参。IRE1α的上游引物为：GCGATGGACTGGTGGTAACT，下游引物序列为：ATGTAGAAGGCCACCACAGG；内参引物序列为：上游：AACGGCACAGTCAAGGCTGA，下游：ACGCCA-GTAGACTCCACGACAT, PCR体系为：cDNA 3 μL 2^*Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL ddH2O 7.5 μL，总反应体系为25 μL；PCR扩增条件为：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，进行35个循环，最后72 ℃延伸7 min，终止反应。IRE1-α、GAPDH的退火温度分别为57 ℃。

1.7 Western Blot检测

取30 mg冻存肝脏组织，采用RIPA裂解液裂解蛋白，BCA法蛋白定量。上样后（50 μg）采用SDS-PAGE凝胶（12%）电泳，半干转膜法转至PVC膜上，采用BSA（5%）封闭2 h，一抗（1:500）于4 ℃孵育过夜，继而孵育二抗（1:5 000），检测蛋白条带灰度进行统计分析。

1.8 统计学方法

实验所得数据均采用SPSS 19.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnttt’s T3法，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠经灌胃治疗后血脂变化

血清TG、TC水平明显改善，见表 1。

2.2 各组大鼠灌胃治疗后血糖、胰岛素水平及胰岛素功能（HOMA-β）指数比较

见表 2。

由表 2可以看出，模型组大鼠各项生化指标皆明显高于空白对照组（P＜0.05），在给予以佩兰中药颗粒治疗后，血脂明显好转，但在降糖及改善β细胞功能方面没有明显意义（P＞0.05），提示佩兰中药颗粒在改善脂代谢紊乱方面有良好的治疗作用。

2.3 IRE1α的mRNA表达情况

见表 3。

与空白对照组相比，模型组表达量明显减少（P＜0.05）。与模型组相比，佩兰中药组的表达量明显升高（P＜0.05）。佩兰中药组与吡格列酮组无明显差异（P＞0.05）。

2.4 各组大鼠肝脏IRE1α的蛋白表达情况

见表 4、图 1。

佩兰中药组与吡格列酮组比较无统计学差异（P＞0.05）。

3 讨论

在内质网应激状态（ERS）下，内质网膜蛋白（PERK、IRE1）和活化转录因子6（ATF6）等跨膜感受蛋白与分子伴侣结合免疫球蛋白78 kDa（GRP-78）发生解离，并活化且启动相应的信号传递URP^[10]。IRE1α激活后在糖脂代谢中发挥重要的作用。在糖代谢方面，目前研究发现，主要是通过对胰岛β细胞的干预来发挥作用。研究表明，在糖尿病基因敲除缺陷大鼠中，与胰岛β细胞IRE1α基因敲除的大鼠相比，正常大鼠在胰岛细胞的数量及功能方面具有明显的优势，但对胰岛素敏感性无明显相关性^[2]；另一方面在脂代谢方面，IRE1α信号通路在脂肪的从头合成、转运以及分解方面都发挥了重要作用。从合成来看，IRE1α可通过IRE1α/XBP通路、IRE1α依赖（RIDD）途径促进脂肪的从头合成^[11]；在转运方面，IRE1α作为TG与极低密度脂蛋白（VLDL）的装配中必需依赖的因子来干预脂肪转运^[12]，轻度的内质网应激可以促进VLDL的合成，高度的内质网应激则会阻碍VLDL的合成，从这一方面来看IRE1在肝脏脂肪变性过程的发挥重要的作用^[13-14]；从脂肪分解角度来看，Joh等^[15]以线虫为模型，研究了饥饿导致的内质网应激通路对脂肪分解影响机制，发现饥饿状态下IRE1α能通过增强脂解酶1（FIL-1）和FIL-2活性来分解线虫体内脂肪颗粒, 从而发现IRE1α在脂肪分解中也发挥重要的作用。另外，有大量研究表明，在内质网应激强度过高、持续时间过长的情况下，IRE1α可以诱导细胞凋亡程序的启动，氨基端激酶（JNK）和丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）在细胞凋亡程序中发挥重要的促进作用，其中JNK可以磷酸化Bcl-2抑制其抵抗细胞凋亡的生物活性，也可以磷酸化Bim、Bax增加其促进细胞凋亡的作用。而激活的p38 MAPK可以磷酸化结合蛋白的同源蛋白（CHOP），诱导Bim和死亡受体5（DR5）的表达增加，同时抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达，从而引起细胞的凋亡^[16-18]。而活化的IRE1α可以活化JNK及p38 MAPK^[19]。本研究发现在IRE1α在2型糖尿病合并脂代谢紊乱大鼠肝脏组织中，空白对照组表达量最高，佩兰中药组的表达量明显高于模型组，具有统计学意义（P＜0.05），提示IRE1α是佩兰的重要作用靶点, 佩兰中药组IRE1α的表达明显高于模型组，推测可能是出于对肝脏的保护，以改善肝脏的脂肪变性；而与空白对照组相比，其余各组大鼠IRE1α的表达量显著下降，可能是由于在此造模条件下应激过强而诱导的细胞凋亡所致。在此实验中可以看出佩兰通过增强IRE1通路的表达进而增加对未折叠或错误折叠蛋白的处理从而减轻了ERS程度。

佩兰作为芳香、化湿、醒脾药，在临床应用中历史悠久，范围广泛，现代药理研究证明，其具有祛痰、抑制细菌、抗炎、增强免疫力、抗肿瘤、抑制轮状病毒、治疗慢性气管炎、肠炎、腹泻以及冠心病等作用^[20]，化浊解毒理论在调节糖脂代谢方面有显著的疗效，而佩兰在其组方中是必不可少的，且理、法、方、药相合，对于合并脂代谢紊乱的2型糖尿病有着重要的临床意义。

综上所述：佩兰具有明显的降脂作用；在高脂饮食联合小剂量STZ尾静脉注射的大鼠模型中，与空白对照组相比，其他各组IRE1α的表达量明显降低；佩兰中药组的肝脏IRE1α的mRNA及蛋白表达水平较模型组明显增高，提示佩兰可以提高2型糖病合并脂代谢紊乱大鼠肝脏中IRE1α的表达；而其提高IRE1α的表达及降低血脂的机制尚需进一步研究。