单核苷酸多态性（SNP），是指基因组DNA序列上群体发生频率大于1%的单个核苷酸差异。SNP最早是作为一种基因组作图的遗传标记，随着研究的进一步深入，发现其本身也可影响基因的功能。SNP可能会影响基因表达水平，影响翻译、剪接、基因的稳定性和蛋白质功能，在常见疾病的发展中具有重要功能。SNP成为遗传和生物医学研究越来越重要的工具。

阿尔茨海默病（AD）临床主要表现为记忆力减退、认知功能障碍等^[1-2]。淀粉样多肽蛋白（Aβ）在细胞内外沉积是其重要病理特征^[3-4]，其生成异常和清除受损导致神经元死亡^[5]。亲环蛋白D（CypD）与线粒体功能密切相关，在AD形成和进展中发挥重要作用^[6-7]。

“三焦针法”注重调节三焦所涵盖的脏腑功能，临床应用具有较好的疗效^[8]。该针法能够改善痴呆鼠学习记忆能力，对痴呆鼠脑神经递质水平、脑内衰老相关基因蛋白表达等均有一定影响^[9]；还可调节十多种功能基因群和蛋白群的表达^[10]。本课题组前期研究^{[6, 11-12]}发现，快速老化小鼠SAMP8皮质、海马神经元中Aβ42、CypD蛋白及mRNA表达量明显上调，且“三焦针法”可下调Aβ42、CypD蛋白及mRNA含量，为进一步探讨快速老化小鼠SAMP8和同品系正常小鼠SAMR1海马、皮质神经元中Aβ、CypD差异表达是否与其基因CDS区DNA序列SNP有关，以及“三焦针法”对Aβ、CypD基因CDS区DNA序列是否有干预作用。本研究以快速老化小鼠SAMP8为模型，采用PCR扩增、SNP一代测序等法比对小鼠皮质、海马组织中Aβ基因CDS区引物设计位点（17个）以及CypD基因CDS区引物设计位点（6个）的DNA序列，并观察“三焦针法”对Aβ、CypD基因CDS区DNA序列是否有干预作用。

1 实验材料与方法 1.1 动物及分组

选取健康雄性8月龄SAMP8快速老化痴呆小鼠和SAMR1同品系正常小鼠, 随机分为SAMP8针刺组、SAMP8空白对照组、SAMR1正常对照组，每组2只。

1.2 穴位的选择和针刺

针刺组取穴膻中、中脘、气海、血海（双侧）和足三里（双侧），血海穴施捻转泻法，其余各穴分别施捻转补法，时间均为30 s。SAMR1正常对照组和SAMP8空白对照组进行相同时间和程度的捉抓。

1.3 DNA提取

分别取25~50 mg小鼠皮质、海马组织用液氮研磨成粉末，利用动物基因组DNA快速抽提试剂盒（上海生工生物工程有限公司）提取DNA，-20 ℃保存。

1.4 引物设计

根据Genebank的数据资料，进行引物设计，一个位点设计一条正向引物和一条反向引物，引物由上海Sangon公司合成, 序列如下:

Aβ-1F5′ AGCACCGGGAGCAGAGCG 3′

Aβ-1R 5′ GCCCCCCACGTCTCGAGAT 3′

Aβ-2F5′ CTGTAGCATGTATATTAGCCCAAC 3′

Aβ-2R 5′ ATCATTAGGAACCAGGATTTTTA 3′

Aβ-3F5′ TTAGAGAATAACGGAACCTTTGA 3′

Aβ-3R 5′ GGCAGTGACATGCTGATAAAAT 3′

Aβ-4F5′ GGTAAGTTCTCTGACCTCCGT 3′

Aβ-4R 5′ AGAGTGAGTACCAGGACAGCC 3′′

Aβ-5F5′ CTGGGCTGTGGCTGTAGTC 3′

Aβ-5R 5′ TATCAAATATAACTGGAGTGAGA GG 3′

Aβ-6F5′ CCTCACGCATTACCAAAGTC 3′

Aβ-6R 5′ CCTTGTGATTTTGGGGGA 3′

Aβ-7F5′ CAGGTCACCACTGGGAGGAT 3′

Aβ-7R 5′ GGTTAGTGGTAGCAACAGTGGG 3′

Aβ-8F5′ CTGCCATCATTCCCACCT 3′

Aβ-8R 5′ ACAAAACCCATGCCAAGC 3′

Aβ-9F5′ GCTCCTCTTTCACACGATTTCT 3′

Aβ-9R 5′ GGGAATCTGTGGCCTTGC 3′

Aβ-10F5′ TTAGTCACATTGGGAGGGG 3′

Aβ-10R 5′ AAGAAGTGAAGAACAAGTGAA GG 3′

Aβ-11F5′ CCCAGTCTACACATGACCTCG 3′

Aβ-11R 5′ TGGCATTTCTCCTAGCTTCTT 3′

Aβ-12F5′ GGCTGGGTATCCATTTATGA 3′

Aβ-12R 5′ GAGATACAACACCCTCACCATAG 3′

Aβ-13F5′ AAGCCCCTTTACTTCAGTGTTC 3′

Aβ-13R 5′ TCCACCAACCCACAAAATG 3′

Aβ-14F5′ TGTTAGGTGGTGCCAAGTGA 3′

Aβ-14R 5′ CACCAGGTCCTTCTCTCAAAA 3′

Aβ-15F5′ CTTGAGAAAAATCCCTAAATCC 3′

Aβ-15R 5′ TTCCCAGTAGTCCTTCTCAGTT 3′

Aβ-16F5′ ACCCACCAACTCACGCTT 3′

Aβ-16R 5′ CACAGAGGGATGTTGCTTTT 3′

Aβ-17F5′ CACGGTTGTTAAGTACTTTGGG 3′

Aβ-17R 5′ GGTTTGTTTCTTTCCACGTTAT 3′

CYPD-1F 5′ GAAGCCAGCCGACCAATA 3′

CYPD-1R 5′ TGATGCCGCCTCTTCTGA 3′

CYPD-2F5′ CATGATGCCCTGGCCTCT 3′

CYPD-2R 5′ TGCTTAGGTTGAGACTCCCATA 3′

CYPD-3F5′ GGACTCAGGAAGAGGGGCA 3′

CYPD-3R 5′ TTCATCCCCACCAGCAGC 3′

CYPD-4F5′ CTGAGGGCGAGCCTTGAG 3′

CYPD-4R 5′ GAGCTGCCTGGATGCTAACA 3′

CYPD-5F5′ GTCCCAGGATCTGCAGGTT 3′

CYPD-5R 5′ CACAGCGAGAAGCAAGCC 3′

CYPD-6F5′ TAGGCTTTCAGGGTAGTGGTG 3′

CYPD-6R 5′ CAGACTCAATAGAAGTGGGTGC 3′

1.5 CDS区引物设计位点选择

根据NCBI数据库的数据资料选取Aβ和CypD基因CDS区，选取Aβ CDS区17个引物设计位点和CypD基因CDS区6个引物设计位点。Aβ和CypD基因所选CDS区引物设计位点如下：

Aβ基因CDS区引物设计位点:395..451, 53256..53423, 70618..70747, 91065..91177, 93920..94113, 117427.. 117629, 130210..130377, 133646..133702, 143588..143721, 148456..148530, 148942..149100，158593..158721, 195668..195889, 202492..202545，208183..208283, 211085.. 211231, 218521..218622。

CypD基因CDS区引物设计位点：659..850, 1900.. 1930, 2431..2519, 4000..4096, 4693.. 4768, 5894..6029。

1.6 目的基因片段的扩增

以基因组DNA为模板，应用多聚酶链式反应（PCR）扩增Aβ、CypD目的基因片段。PCR反应体系：Taq buffer 5.0 μL，Taq酶0.5 μL（5×10⁶ U/μL），MgCl 25.0 μL（25 mol/L），dNTP 1.0 μL（10 mol/L），上、下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，水35.5 μL。PCR反应条件：1）95 ℃预变性3 min。2）94 ℃变性30 s，55~60 ℃退火35 s，72 ℃延伸40~50 s。3）修复延伸5~8 min，扩增35个循环。

1.7 SNP测序

利用ABI第一代测序仪，对上述PCR扩增产物进行测序。

2 实验结果

PCR反应产物测序结果见测序图谱（以模型组皮层Aβ1号引物和CypD1号引物测序图谱为例，见图 1~2）。（测序图谱使用说明：峰图文件及序列比对可用SeqMan软件打开）。

利用SeqMan软件分别对Aβ、CypD基因DNA测序结果进行比对，结果发现：SAMR1正常组、SAMP8对照组小鼠皮质、海马Aβ和CypD基因CDS区引物设计位点DNA序列均未发生SNP，针刺组小鼠皮质、海马Aβ和CypD基因CDS区引物设计位点DNA序列未发生改变。

3 讨论

SNP最早是作为一种基因组作图的遗传标记，随着研究的进一步深入，发现其本身也可影响基因的功能。不同类型的SNP可通过类似或不同的分子机制，分别在基因转录水平、转录后水平、翻译水平、翻译后蛋白折叠等方面对基因功能的发挥进行影响。大量研究表明个体间的遗传差异会影响其对复杂疾病的易感性，SNP已经成为复杂疾病研究的重要切入点^[13]。吕小荣等^[14]发现载脂蛋白E基因单核苷酸多态性能不同程度的增加轻度认知障碍和AD的发病风险。SNP在常见疾病的发展中也具有重要功能，一些研究已经确定SNP与多种常见疾病如AD、高血压、肥胖、类风湿性关节炎、冠心病等^[15]有关。研究发现miR-146a前体单核苷酸多态性通过干扰miR-146a产物增加AD遗传易感性^[16]。

“三焦针法”是韩景献教授基于“三焦气化异常导致老年性痴呆的创新病机”所设，临床应用具有较好的疗效^[8]。该针法能够改善痴呆鼠学习记忆能力，对痴呆鼠脑神经递质水平、脑抗氧化酶活性、脑内衰老相关基因蛋白表达、G蛋白信号转导等均有一定影响^[9]；还可调节十多种功能基因群和蛋白群的表达，包括转录和翻译因子、细胞凋亡、细胞周期、DNA修复酶类等^[10]。前期研究^{[6, 11-12]}发现，快速老化小鼠SAMP8皮质、海马神经元中Aβ42、CypD蛋白及mRNA表达量均明显上调，“三焦针法”可下调Aβ42、CypD蛋白及mRNA含量。本研究发现，SAMR1正常对照组、SAMP8对照组小鼠皮质和海马中Aβ、CypD CDS区引物设计位点DNA序列均未发生SNP，针刺组小鼠皮质、海马Aβ和CypD CDS区引物设计位点DNA序列未发生变化，说明Aβ、CypD mRNA及蛋白差异表达与其基因CDS区DNA序列SNP无关，“三焦针法”对Aβ、CypD基因CDS区DNA序列无干预作用，并进一步推测AD的发生与Aβ、CypD基因CDS区DNA序列SNP无关，“三焦针法”对Aβ、CypD mRNA及蛋白表达水平的调节作用并非通过改变Aβ、CypD基因CDS区DNA序列的途径实现的，而Aβ、CypD mRNA及蛋白差异表达以及“三焦针法”对Aβ、CypD mRNA及蛋白表达水平的调节作用机制有待于进一步研究。