流感病毒（Ⅳ）是临床常见呼吸道感染病原，常常引起上呼吸道感染、肺炎等呼吸系统疾病。有报道表明，2009年4月源于北美的新型甲型流感席卷全球，并导致万余人死亡^[1]，因此，流感病毒一直是医学界研究的重点。笔者在有关流感病毒实验动物模型制做过程中发现，幼鼠龄对流感病毒具有更强的易感性，造模更易成功。本研究通过建立流感病毒感染动物模型幼龄鼠与成年鼠对照实验研究，比较不同鼠龄昆明种小鼠在流感病毒肺炎动物模型的建立中的易感性，为成功建立流感病毒肺炎动物模型提供实验依据。

1 材料 1.1 病毒

甲型流感病毒流感病毒鼠肺适应株A/ FM1/47（H1N1），中国预防医学科学研究院病毒研究所提供，冻存于辽宁中医药大学病毒实室。解冻后经9日龄尼克白种鸡胚（SPF级，购买于辽宁益康生物制品厂）的尿囊腔接种培养传代后为FM1M9E2M1E3M2E4M1E5。微量血凝实验滴定效价，血凝效价1:1 280者供实验用。

1.2 实验动物

昆明种小白鼠，清洁级，雌雄各半，鼠龄各半，幼龄鼠选3~4周龄，体质量12~14 g，成龄鼠选8~12周龄，体质量20~28 g。由辽宁中医药大学实验动物中心提供。小鼠置于无病原体清洁笼内饲养，饲料和饮用水经高温高压消毒。

1.3 主要试剂

无水乙醚、4%多聚甲醛、二甲苯、乙醇、伊红、蒸馏水、中性树胶；TRIZOL总RNA提取试剂（批号：1203405，Invitrogen公司）；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（批号：Bk2201，宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）产BcaBEST RNA RCR Kit Ver.1.1）；DEPC（批号：BBI0916S03，宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）产）；DNA-marker DL2000（批号：CB3301，宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）产）；Ⅳ引物由宝生物工程（大连）有限公司合成；

1.4 主要仪器及设备

Ⅱ级生物安全柜（美国Baker公司：SG403TXCE）；精密转轮切片机（RM2135，德国，LEICA）；系统生物显微镜（BX50F4，日本，OLYPUS）；台式压力蒸汽灭菌器（沈阳盛达生物电子设备有限公司）；AR2140电子分析天平（上海奥豪斯公司）；电热恒温干燥箱（宁波机电工业研究设计院；GZX-DH400-S）；低温冰箱（意大利Indesit；C232NWI）；低温高速离心机（德国Heraeus；BIOFUGE28RS）；蛋白-核酸分析仪（DU-600，美国Beckman）；PCR仪（PE-9600，美国PERKIN ELMER）；低温高速离心机（BIOFUGE28RS德国HERAEUS）；电泳仪（EPS-300）天能凝胶分析系统（上海天能）。

2 方法 2.1 甲型流感病毒

FM1株对小鼠半数致死量（LD₅₀）的测定^[2]将Ⅳ增毒后的新鲜尿囊液（血凝滴度1:1 280）10倍系列稀释6个浓度（10^-1~10^-6），将30只幼龄昆明种小鼠随机分6组，每组5只。在乙醚麻醉下经鼻腔接种甲型流感病毒FM1株，每组接种同一个浓度（每只0.05 mL）；连续观察14 d，记录小鼠死亡情况，并进行死亡百分率统计，计算Ⅳ小鼠半数致死量。

2.2 分组

依据随机数字表法，将80只昆明种幼龄鼠随机分为：幼龄模型组40只、幼龄正常组40只；将80只昆明种成龄鼠随机分为成龄正常组40只，成龄模型组40只。

2.3 模型复制

除幼龄正常组和成龄正常组外，各组均造模。依照文献[2]取一个200 mL烧杯，杯中放脱脂干棉团，将干棉团倒入无水乙醚至浸湿程度，将小鼠扣入带棉团的烧杯中。见小鼠极度兴奋后，明显呈无力样，躺倒片刻，马上取出，将小鼠腹部朝上，头仰起，用注射器每鼻孔15LD₅₀ Ⅳ液0.05 mL，建立Ⅳ感染小鼠模型。各正常组在同等条件下接种等量不含病毒的生理盐水。

2.4 标本取材

各组小鼠分别于造模后第3、5、7天，处死动物取材，每组各取10只。处死前禁食禁水8 h，称质量后断颈处死取肺组织。

将肺组织放入无菌生理盐水中洗涤两次，用无菌滤纸吸干表面水分，观察并记录病变程度，称肺质量；取左侧肺叶放入无菌EP管中，迅速置于冰壶中，在-80 ℃冰箱中保存，用于RT-PCR检测；右侧肺叶用于病理、免疫组织化学检测。

2.5 模型鉴定 2.5.1 动态观察小鼠生命状态

每天观察记录各组小鼠、皮毛色泽、饮食、活动情况和精神状态，定期测量体质量。

2.5.2 肺组织病理观察

常规石蜡包埋，切片，苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察肺组织病理学改变。

2.5.3 计算肺指数

小鼠取材前，应用电子天平测定小鼠体质量，取肺组织后测定肺质量，记录。肉眼评价肺部病变程度，进行肺指数计算。肉眼观察肺部病变程度评判标准：以-、1+、2+、3+、4+表示（结果见表 3）。-：全肺野无病变；1+：全肺野实变＜25%；2+：全肺野实变占25%~49%；3+：全肺野实变占50%~75%；4+：全肺野实变占＞75%。肺指数=小鼠肺质量（g）/小鼠体质量（g）×100%。

2.6 RT-PCR法检测肺组织悬液Ⅳ总RNA 2.6.1 总RNA提取

取50 mg肺组织，加入1 mL TRIZOL试剂匀浆，超声破碎3 s 15次；样品收入EP管中，室温放置10 min，加200 μL氯仿，剧烈震荡15 s室温放置2~3 min，4℃ 12 000 r/min离心15 min；吸取上清液移入新EP管中，加入5 mL异丙醇，摇匀，室温放置10 min沉淀RNA，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min；弃上清，RNA沉淀经75%乙醇1 mL，4 ℃ 7 500 r/min离心5 min，最后用适量的无RNase水（dH₂O）溶解RNA沉淀。总RNA经蛋白核酸分析仪测定OD₂₆₀和OD₂₈₀值，计算总RNA含量。

2.6.2 逆转录cDNA

混匀后按以下条件进行反转录反应。取总RNA 1 μL加入20 μL的反转录体系：2×Bca 1st Buffer 10 μL，25 mmol/L MgSO₄ 4 μL，dNTP Mixture 1 μL，RNase Inhibiter（40 U/μL）0.5 μL，BacBEST Polymerase (22 U/μL）1 μL，Random 9mers 1 μL，总RNA 1 μL，dH₂O（RnaseFree）1.5 μL，合计20 μL。

65 ℃ 1 min、30 ℃ 5 min、15~30 min内匀速升温至65 ℃、65 ℃ 15~30 min、98 ℃ 5 min、5 ℃ 5 min。

2.6.3 PCR扩增

Ⅳ、GAPDH引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，序列如下。

GAPDH上游5' GACATCAAGAAGGTGGTGA AG 3'

下游5' TGGAAATTGTGAGGGAGATGC 3'计336 bp

Ⅳ上游5' GAGAAAGAAGTCCTTGTGC 3'

下游5' TCTATCATTCCAGTCCATCCC 3'计530 bp

取cDNA 4 μL用于50 μL PCR扩增，PCR扩增体系内如下：MgSO₄（25 mmol/L）4 μL，5×2^nd Buffer 10 μL，Bca-optimized Taq（5 U/μL）0.5 μL，Ⅳ上、下游引物（20 pmol/μL）各1 μL，内参上、下游引物（2 pmol/μL）各1 μL，dNTP Mixture（各10 mmol/L）1 μL，dH₂O 28.5 μL，cDNA模板4 μL，合计50 μL。

混匀后按以下条件进行扩增。

94 ℃ 3 min预变性，94℃ 30 s、56℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30个循环后72 ℃延伸5 min。

2.6.4 电泳

RT-PCR产物经2%琼脂糖电泳、电压条件为5 v/cm，溴化乙锭染色后紫外灯下观察特异光带。

2.6.5 结果分析

应用天能凝胶分析系统摄像、分析电泳结果，以内参照为标准进行半定量分析。分析系统测定特异产物条带和内参照的强度，计算特异扩增产物的相对量T，计算公式为：T=特异产物条带的强度/内参照的强度×100%。

2.7 统计学分析

采用SPSS18统计软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多个样本比较采用重复测量方差分析，计数资料组间比较采用χ²检验，等级资料采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 甲型Ⅳ株对小鼠半数致死量（LD₅₀）的测定

各组小鼠接种Ⅳ后，连续观察14 d，小鼠死亡情况见表 1。

应用Reed和Muench公式计算LD₅₀。

距离比例=（高于50%的死亡百分数-50）/（高于50%的死亡百分数-低于50%的死亡百分数）=（66.7-50）/（66.7-14.3）=0.32。

LD₅₀=高于50%的死亡的病毒最高稀释度的对数+距离比例=4+0.32=4.32。

3.2 不同时间点各组小鼠一般状态观察

见表 2。结果表明：幼龄及成龄正常组小鼠一般状态最好。幼龄模型组一般状态最差，造模第1天共死亡1只，至第3天共死亡4只，到第5天出现死亡高峰，至第14天共死亡9只，成龄模型组基本保持较好状态，14 d内死亡2只。

3.3 不同时点各组小鼠肺组织外观病变程度

不同时点取小鼠肺组织，观察其外观病变程度，结果显示：各正常组小鼠在不同时点肺组织外观全肺野无病变；幼龄模型组肺组织病变最重，各时间点与幼龄正常组及成龄模型组比较均有统计学差异（P＜0.05），成龄模型组各时间点与成龄正常组比较无统计学差异（P＞0.05），与幼龄模型组有统计学差异（P＜0.05）。结果见表 3。

3.4 肺指数比较

幼龄和成龄正常组小鼠在不同时点肺指数最低。幼龄模型组肺指数最高，与幼龄正常组及成龄模型组比较均有统计学差异（P＜0.05），感染第5天肺指数达到最高。成龄模型组肺指数与成龄正常组比较无统计学差异（P＞0.05），与幼龄模型组比较有统计学差异（P＜0.05），其肺指数明显低于幼龄模型组肺指数。各组小鼠不同时点肺指数水平见表 4。

3.5 各组小鼠肺组织中不同时点Ⅳ-RNA的半定量测定

各正常组小鼠各时点肺组织中未检测到Ⅳ病毒核酸，幼龄模型组在各时点均检测到大量的病毒核酸，在第5天病毒核酸量最大，为2.123 8± 0.277 4，幼龄模型组各时间点与成龄模型组比较有统计学差异（P＜0.05）。成龄模型组各时点Ⅳ病毒核酸只有微量表达，与幼龄模型组比较有统计学差异（P＜0.05），与成龄正常组比较，无统计学差异（P＞0.05）。各组小鼠肺组织不同时点Ⅳ-RNA的半定量测定结果见表 5。

4 讨论

流行性感冒是第一个实行全球性监测的病毒性急性呼吸道传染病，它是一种由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，据报道，甲型流感流行时肺炎的发生率为5%~38%^[3]。流感病毒传染性强，又因流感病毒易于变异和动物宿主的广泛而难以治疗和预防，因此无论是临床还是实验研究都是医界关注的重点。

笔者前期进行了系列关于银翘散防治流感病毒的实验研究。在进行Ⅳ动物模型制作过程中发现，幼鼠对流感病毒更具有易感性，幼鼠为流感病毒感染模型的最佳受试体，而体质量和龄鼠偏大的小鼠往往不易造模成功^[4-7]。为此，查阅大量国内外文献^[8-14]，发现文献中建立Ⅳ感染小鼠模型所选用的小鼠周龄一般集中在3~6周龄左右，体质量集中在12~18 g左右，很少有选用成年鼠建立Ⅳ感染模型。幼龄鼠对流感病毒易感这一特点与临床上观察发现儿童Ⅳ易感性较强十分吻合，为此，对流感病毒肺炎动物模型建立中鼠龄的选择进行了系统深入研究，比较了不同鼠龄昆明种小鼠对流感病毒的易感性。

本研究依照郭元吉的方法, 以Ⅳ鼠肺适应株滴鼻建立小鼠肺炎模型。通过幼龄鼠与成龄鼠建立Ⅳ肺炎动物模型的对照实验研究，观察小鼠一般状态及存活只数，比较各组小鼠的肺组织病变程度、肺指数，测定小鼠肺组织中不同时点Ⅳ-RNA的病毒载量等。

从感染Ⅳ后小鼠的一般状态观察来看，幼龄模型组小鼠一般状态最差。造模第5天出现死亡高峰，至第14天共有9只死亡；成龄模型组小鼠一般状态较好，与成龄正常组小鼠状态相似，14 d内只有2只死亡。

从肺组织病理来看，各正常对照组小鼠肺肺泡腔大小较一致，支气管上皮完整，管腔无分泌物，外周未见炎性细胞浸润，肺泡壁不增厚；成龄模型组肺组织病例情况与正常组相似，只有个别小鼠见支气管壁有少许单核细胞浸润，肺泡壁略增厚，管腔内无渗出，病变面积小于整个肺野的25%；幼龄模型组呈现最重的病理改变，支气管上皮脱落，管壁血管扩张充血，见大量炎性细胞浸润，形成实变区，病变面积占整个肺野25%以上的较多。肺病理结果表明，幼龄模型组流感病毒感染模型造模成功，成龄鼠不能成功造模。

各组小鼠肺指数比较结果表明：各正常组小鼠在不同时点肺指数最低。幼龄模型组肺指数最高，与幼龄正常组及成龄模型组比较均有统计学差异（P＜0.05）。成龄模型组肺指数与成龄正常组比较无统计学差异（P＞0.05），其肺指数明显低于幼龄模型组肺指数。

各组小鼠肺组织中不同时点Ⅳ-RNA的半定量测定结果表明：各正常组小鼠各时点肺组织中未检测到Ⅳ病毒核酸，幼龄模型组在各时点均检测到大量的病毒核酸，成龄模型组各时点Ⅳ病毒核酸只有微量表达，与幼龄模型组比较有统计学差异（P＜0.05）。

以上结果证明，以Ⅳ鼠肺适应株滴鼻建立小鼠肺炎模型，幼龄模型组流感病毒感染模型造模成功，成龄鼠不能成功造模。该实验研究结果确证了幼龄鼠对流感病毒的易感性，说明鼠龄在3~4周、体质量在12~14 g的幼龄鼠更适合作为流感病毒肺炎动物模型的载体。