糖代谢紊乱引起的血糖水平升高，是造成糖尿病的直接原因，胰岛B细胞分泌的胰岛素，可加速糖原的合成及机体对血糖的吸收利用，降低血糖水平，当胰岛B细胞功能异常，胰岛素分泌不足，则引起血糖水平升高^[1]。近年研究发现，c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号转导通路对胰岛B细胞具有较强的调控作用，JNK蛋白激活后可抑制胰岛素信号转导通路、胰岛B细胞特异基因的表达，造成胰岛素分泌减少，引起血糖水平升高^[2]。研究JNK信号通路在调节血糖、治疗糖尿病方面具有重要意义。

消渴灵片选用熟地黄、黄芪等具有生津止渴功效的药材，具有补阴益气、行气通瘀、清热化痰的功效，在调节血糖、治疗糖尿病方面具有较好的临床效果。本研究以高糖高脂食物联合链脲佐菌素（STZ）制备2型糖尿病模型大鼠，观察消渴灵片对模型大鼠血液指标、JNK mRNA、p-JNK蛋白及PDX-1蛋白表达的影响，探究其可能的降糖机制。

1 材料 1.1 材料与试剂

消渴灵片（陕西金象制药有限公司，批号20160826）；链脲佐菌素（南京生兴生物技术有限公司，批号160406）；盐酸二甲双胍（天津亚宝药业科技有限公司，批号20160422）；葡萄糖测定试剂盒（宁波市慈城生化试剂厂，批号20160223）；胰岛素放免分析试剂盒（天津新传生物技术有限公司，批号20160306）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（南京建成生物工程研究所，批号20160104）；兔抗鼠磷酸化JNK多克隆抗体（Santa，美国）；免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2 实验仪器

D8系列紫外可见分光光度计（南京菲勒仪器有限公司）；HH6003γ-放射免疫分析仪（北京核海高技术开发公司）；PT-620半自动生化分析仪（北京普天新桥技术有限公司）；TDL-40C低速台式离心机（苏州欧倍科学仪器有限公司）；QuantStudio^TM 12K Flex实时荧光定量PCR仪（ABI，美国）。

1.3 实验动物

Wistar大鼠，雄性，体质量（160± 10）g，购自天津实验动物中心，合格证号为SCXK（津）2016-0011。喂养期间自由摄食饮水，环境温度（24±3）℃、相对湿度40%~60%。

2 方法 2.1 大鼠模型的制备

实验大鼠适应性喂养1周后，给予高脂高糖食物（15%白砂糖，15%猪油，4.5%胆固醇，65.5%基础饲料）喂养4周，禁食12 h后，50 mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素-柠檬酸缓冲溶液（pH4.5），给药48 h后，尾静脉采血，测定大鼠空腹血糖（FBG）、总胆固醇（TC）及甘油三酯（TG）含量。

2.2 分组及给药

选取造模成功大鼠50只，按随机数字表法随机分为5组，分为模型组，XKL低、中、高剂量组[分别以2、4、8 g/kg XKL作为低、中、高剂量灌胃]、阳性对照组（以0.8 g/kg盐酸二甲双胍灌胃），另取基础喂养大鼠10只，作为正常组。模型组及正常组给予同等体积生理盐水，给药期间全部大鼠基础饲料连续喂养28 d。

2.3 检测指标及方法 2.3.1 血液指标检测

末次给药后禁食12 h，1%戊巴比妥钠溶液40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，分离血清，TC、TG采用自动生化分析仪测定，放射免疫法测定FINS；生物试剂盒测定FBG、MDA、SOD。

2.3.2 JNK mRNA表达的检测

末次给药后禁食12 h，1%戊巴比妥钠溶液40 mg/kg腹腔注射麻醉，处死大鼠，分离胰腺组织，称取胰腺组织100 mg，加入RNAiso Plus试剂提取总mRNA；检测mRNA纯度及完整性，按照逆转录试剂盒操作说明，实验结果采用2^-△△Ct法计算相对表达量。

2.3.3 JNK及PDX-1蛋白表达的检测

末次给药后禁食12 h，1%戊巴比妥钠溶液40 mg/kg腹腔注射麻醉，处死大鼠，分离胰腺组织，胰腺组织裂解、匀浆，12 000×g，4 ℃离心10 min分离上清液，应用BCA试剂盒操作进行蛋白含量测定，配制SDSPAGE分离胶、浓缩胶，进行电泳、转膜、封闭，分别将PVDF膜用稀释好的p-JNK、JNK、PDX-1一抗（1:3 000，5%脱脂奶粉稀释），进行孵育，4℃摇荡过夜，再用荧光二抗（1:5 000稀释）室温孵育1.5 h，ECL发光显色，凝胶成像仪曝光成像。Image J软件分析条带灰度，读取各条带校正积分光密度值，并进行半定量分析，以β-actin作为内参照，PDX-1蛋白含量用A_PDX-1/A_β-actin表示；p-JNK蛋白含量用A_p-JNK/ A_JNK表示。

2.4 数据处理

采用SPSS19.0统计软件对实验数据进行处理，数据以均数±标准差（x±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析Oneway ANOVA检验，组间两两比较若方差齐用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果 3.1 模型大鼠血液指标变化情况

模型大鼠在经高糖高脂食物喂养4周后，与正常组大鼠比较，FBG、TC及TG含量均显著升高，FBG≥16.7 mmol/L，表明大鼠模型制备成功，见表 1。

3.2 XKL对大鼠血液各指标的影响

XKL可显著降低模型大鼠FBG、TC、TG水平，XKL对模型大鼠FBG水平变化的影响最为明显，XKL低、中、高剂量组与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）；同时XKL对血清TC及TG含量也有较明显的调节作用，中、高剂量组与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），表明XKL可有效改善模型大鼠血糖血脂指标，结果见表 2。

XKL可显著降低模型大鼠MDA水平，提高FINS水平及SOD活性，中、高剂量组与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），XKL可降低MDA含量并提高SOD活性，XKL中、高剂量组可显著降低MDA含量，与模型组比较（P＜0.05），表明XKL可有效降低模型大鼠体内氧化应激水平，结果见表 3。

3.3 JNK mRNA表达情况

与正常组比较，模型组JNK mRNA相对表达量显著升高（P＜0.01），表明JNK信号通路激活；与模型组比较，XKL及阳性对照组均可降低JNK mRNA的相对表达量，XKL中剂量与模型组差异有统计学意义（P＜0.05），XKL高剂量组及阳性对照组与模型组差异同样具有统计学意义（P＜0.01），表明XKL可有效降低JNK mRNA的相对表达量，抑制JNK信号通路的过度活化，实验结果见表 4。

3.4 p-JNK及PDX-1蛋白表达情况

与正常组比较，模型组p-JNK蛋白表达量显著升高，表明JNK信号通路活化；与模型组比较，XKL可显著降低模型大鼠p-JNK蛋白的表达水平，XKL中、高剂量与模型组比较差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），二甲双胍对p-JNK蛋白的表达无直接作用，与模型组比较无统计学意义（P＞0.05）；与正常组比较，模型组PDX-1蛋白表达量显著减少，XKL各剂量组均可增加PDX-1蛋白表达量，中、高剂量与模型组比较差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；XKL对p-JNK及PDX-1蛋白表达的影响具有一定的剂量效应，见图 1-3。

4 讨论

中药在治疗糖尿病方面拥有悠久历史，具有安全有效，毒副作用低，标本兼治的特点，糖尿病属于中医“消渴”范畴，“本虚标实为病机，气虚阴亏为其病本，血瘀痰湿之标贯穿其中”^[4-5]。消渴灵片选用熟地黄、黄芪、麦门冬、黄连、牡丹皮等药材，其中熟地黄补阴益气、黄芪补气固表、麦门冬养阴生津、黄莲清热解毒、牡丹皮行气通瘀，上述诸药合用具有生津止渴、补阴益气、清热解毒、抗菌消炎等功效^[6-7]。消渴灵片全方攻补兼施，标本同治，补阴益气，化瘀除湿，扶正祛邪，针对病机治疗糖尿病。

氧化应激被认为是糖尿病重要发病机制之一^[8-9]，氧化应激反应引起体内SOD活性降低，导致机体氧自由基大量产生，对本身缺乏抗氧化酶的胰岛B细胞更易造成氧损伤，引起胰岛B细胞功能受损，胰岛素分泌减少，血糖代谢紊乱^[10]。JNK属于丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，是信号传导过程中重要传递物质，可将机体信号由细胞表面传递细胞核内，使核内相应基因发生表达调节靶细胞功能^[11]。JNK信号通路对氧自由基极为敏感，易被氧自由基激活，JNK信号转导通路对胰岛B细胞具有较强的调控作用，在JNK信号通路激活后，影响PDX-1转录因子功能，造成胰岛素及胰岛细胞特异基因无法正常表达，糖代谢紊乱引起血糖升高，导致糖尿病的发生^[12-13]。同时有研究表明，JNK信号通路在受到抑制后，胰岛素抵抗作用降低，表明JNK信号通路的激活对胰岛素抵抗也发挥着重要作用^[14-15]。氧化应激反应造成的氧自由基含量升高，可直接损伤胰岛细胞，同时氧自由基还可以激活JNK信号通路，进一步影响胰岛细胞功能，造成胰岛素分泌的减少。

本研究发现，与模型组比较，XKL可有效降低FBG及MDA含量，显著提高FINS水平及SOD活性，表明XKL具有良好降低血糖及氧化应激反应的作用，可有效促进胰岛素的分泌；XKL干预后模型大鼠PDX-1蛋白表达量显著升，p-JNK蛋白及JNK mRNA表达量显著下降，表明JNK蛋白通路过度激活的情况被抑制，XKL可以有效降低体内氧化应激水平及抑制JNK信号通路的过度激活。XKL在降血糖、增加胰岛素分泌、降低氧化应激反应、抑制JNK信号通路等方面具有较强的剂量效应。

综上所述，XKL降糖机制可能是通过降低氧化应激水平，抑制JNK信号通路活化，保证胰岛素的分泌及胰岛细胞的正常增殖分化，调节血糖水平，进而治疗糖尿病。