糖尿病周围神经病变（DPN）是糖尿病的常见并发症，其临床表现常为下肢的感觉异常、疼痛，足部皮温降低、怕冷，皮肤色淡，足背动脉搏动减弱等症状。中医认为本病多为寒湿闭阻经络，阳失温煦下肢所致。乌头汤具有温经散寒、通络止痛之功效，临床工作中将该方化裁用于改善DPN的以上症状常可获得较满意疗效。本实验通过观察乌头汤对DPN大鼠胫神经组织酪氨酸蛋白激酶A（TrkA）、p75神经营养因子受体（p75NTR）及血清神经生长因子（NGF）的影响，探索该方的可能作用机制。

1 材料与仪器 1.1 动物及分组

Wistar大鼠60只，6周龄，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。室温（22±2）℃，保持安静。动物分层随机分入空白组、模型组、乌头汤组，每组20只，雌雄各半。

1.2 主要试剂

链尿佐菌素（STZ）Sigma-S0130，（批号：082k0827）；大鼠TrkA、p75NTR、NGF ElISA Kit均购自上海邦奕生物科技有限公司（批号：201512）；Anti-TrkA抗体、Anti-p75NTR抗体均购自艾博抗（上海）贸易有限公司。

1.3 主要设备

酶标仪：芬兰（Labsystems Multiskan MS），仪器型号：352型；洗板机：芬兰（Thermo Lab-systems），仪器型号：AC8；离心机：微量高速离心机（国产），仪器型号：TG16W；培养箱：隔水式恒温培养箱（国产），仪器型号：GNP-9080；血糖仪及试纸：长沙三诺生物传感技术有限公司。

1.4 药物制备

中药饮片（麻黄、赤芍、黄芪、炙甘草、制川乌头）均购自于天津市中医药研究院附属医院中药房。乌头汤按如下方法制备：麻黄、赤芍、黄芪、炙甘草各15 g，制川乌头30 g。制川乌头先煎3 h，再加入其他药物煎煮两次，每次30 min，分别得药汁后混合，并以65 ℃水浴浓缩至100 mL（相当于生药0.90 g/mL）。

2 实验方法 2.1 模型制备

动物适应性喂养1周后开始造模：1）禁食8 h后，按75 mg/kg腹腔注射STZ（采用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，调整pH至4.2~4.6，STZ浓度为10 g/L）；空白组腹腔注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。1周后剪尾采血测定空腹血糖（FBG），FBG高于16.7 mmol/L（3 000 mg/L）的样本为合格。对不合格样本予以剔除。2）根据相关文献，糖尿病模型复制成功并维持高血糖水平6周后可形成DPN^[1]。故于第6周末测定缩足反应阈值，较空白组平均水平升高2.0 g以上者为DPN模型合格。对不合格样本予以剔除。缩足反应阈值检测方法参考王汉兵文献[2]。

2.2 给药方法

干预药物制备后，经动物体表面积计算大鼠的相应给药量为10 mL/kg。乌头汤组每日灌胃1次，模型组及空白组采用等剂量蒸馏水灌胃。中药干预从DPN造模成功后介入，持续4周。

2.3 指标及检测

动物空腹8 h后以10%水合氯醛腹腔注射（350 mg/kg）麻醉，麻醉后立即手术分离双侧胫神经，下腔静脉取血。左侧胫神经按照1 g组织加入9 mL磷酸盐缓冲溶液（PBS）制备组织匀浆，酶联免疫吸附测定法（ELISA法）检测TrkA和p75NTR含量，操作严格按照试剂盒说明书进行。右侧胫神经以30%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，免疫组化法染色，Anti-TrkA的稀释度为1:50、Antip75NTR的稀释度为1:100，阴性对照片省去“一抗”，光镜下采集图片观察TrkA和p75NTR在神经纤维中雪旺细胞表面的表达。药物干预前以剪尾采血法测定FBG，干预后测定静脉血FBG。静脉血制备血清后以ELISA法检测NGF含量，操作严格按照试剂盒说明书进行。

2.4 统计学分析

数据分析采用SPSS 19.0统计软件处理，各组数据均以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果 3.1 对FBG的影响

不论是干预前还是干预后，乌头汤组和模型组FBG均较空白组升高（P＜0.01）；乌头汤组与模型组间FBG均无统计学差异（P＞0.05）。各组内FBG在干预前后均无统计学差异（P＞0.05）。

3.2 对TrkA、p75NTR及NGF水平的影响

模型组神经组织TrkA、p75NTR及血清NGF较空白组均无统计学差异（P＞0.05）；与模型组比较，乌头汤组血清NGF含量明显升高（P＜0.05），神经组织p75NTR明显降低（P＜0.05），神经组织TrkA无统计学差异（P＞0.05）。

3.3 对雪旺细胞TrkA、p75NTR表达的影响

免疫组化染色阳性产物呈浅棕色至棕黄色，其染色的深浅反应目标蛋白阳性表达强弱，阴性对照片不着色。三组间TrkA阳性表达未见明显差异（见图 1a、图 1b、图 1c）。模型对照组p75NTR着色较空白组和乌头汤组加深，提示其阳性表达程度较另两组增强（见图 1d、图 1e、图 1f）。

4 讨论

有报道称糖尿病患者中约有61.8%并发DPN^[3]，而在病程大于15 a的糖尿病患者中近乎全部都合并DPN^[4]。即使在新诊断糖尿病足病患者中伴随DPN病变者也占到了46.06%^[5]。DPN严重影响患者的生活质量，造成家庭甚至社会负担，占用和消耗大量社会医疗资源。

p75NTR与TrkA均为NGF受体。p75NTR的胞内区含有可通过调节凋亡信号而诱导神经元凋亡的区域^[6]。当p75NTR与TrkA同时表达时，p75NTR可通过强化NGF与TrkA的结合而促进其效应发挥，而在缺乏p75NTR时NGF-TrkA的促神经生长作用消失。这可能是通过p75NTR跨膜区的螺旋结构与TrkA形成二聚体^[7]，继而改变TrkA上与NGF特异性结合的结构域而改变TrkA与NGF的亲和力，使信号蛋白在下游级联反应中增强而实现的^[8]。p75NTR既可以作为TrkA的协同受体，通过与TrkA协同作用，促进神经元生长，也可直接与神经营养素结合而介导神经元及胶质细胞凋亡^[9]。p75NTR对配体NGF或神经生长因子前体（proNGF）具有相同的亲合力；而TrkA与NGF亲和力更高，将proNGF裂解后的pro结构域与TrkA结合，同样能产生促神经生长作用。因此神经细胞是凋亡抑或存活，需由NGF：proNGF与p75NTR：TrkA的比例来决定^[10]。高糖可造成proNGF增多，打乱NGF与proNGF平衡。

乌头汤出自《金匮要略》，文载“：疼痛，不可屈伸，乌头汤主之。”本方多用于治疗以关节疼痛、肿胀，活动受限为主的肌肉骨骼系统和结缔组织疾病^[11]。本实验并未发现DPN大鼠神经纤维TrkA的表达在3组间有明显的差异，而乌头汤组较模型对照组胫神经组织p75NTR含量降低，免疫组化也显示乌头汤组较模型对照组p75NTR染色阳性程度明显降低。因而可以认为调整NGF的两个受体的协同作用也可能是本方的作用机制之一，高糖可导致神经髓鞘雪旺细胞NGF水平降低，并且与共培养的神经元轴突的协调生长也较差^[12]。乌头汤组血清NGF较模型组升高，也可能是其促进神经修复、再生，预防DPN进展的原因之一。实验结果所示，乌头汤组与模型组间血糖并无差异，并且各组内干预前后FBG水平也没有明显变化，从而可知乌头汤对NGF和p75NTR的干预作用并非通过调整血糖而达到的。并且模型对照组NGF较空白组并无明显差异，提示乌头汤对NGF的干预作用亦不依赖其原有的病理变化，其具体原因尚需进一步探索。