番茄红素（LP）是一种具有抗氧化、增强机体免疫力等多种药理学作用的类胡萝卜素^[1-2]，广泛存在于红色蔬菜和水果中。LP分子式C₄₀H₅₆，分子量536.88。近年来LP抗肿瘤作用也逐渐得到广大医药研究者的普遍关注，既往体外细胞实验研究发现，LP原型可通过抑制肿瘤细胞增殖或促进其凋亡而对肺癌、胃癌、卵巢癌等均具有一定的抑制作用^[3-5]，但LP是否对骨肉瘤生长具有一定的抑制作用尚未见文献报道，本研究通过体外培养人骨肉瘤MG-63细胞并给予LP进行干预，制备荷骨肉瘤裸小鼠模型并给予LP进行干预治疗，以顺铂为阳性对照，研究LP对骨肉瘤细胞增殖及荷骨肉瘤裸小鼠肿瘤生长的影响。

1 材料与方法 1.1 细胞和动物

人骨肉瘤MG-63细胞株由河北医科大学细胞生物研究室惠赠；实验用雄性Balb/C裸小鼠（鼠龄4~6周龄，体质量18~22 g）购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号：SCXK（沪）2012-0005。

1.2 药物与试剂

番茄红素购自南京泽朗生物科技有限公司（纯度≥96%）；注射用顺铂购自山东齐鲁制药有限公司；RPMI-1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购自美国HyClone公司；噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司；Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（bcl-2）、bcl-2相关x蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）单抗购自碧云天生物技术有限公司；苏木精-尹红（H & E）、末端标记染色法（TUNEL）试剂盒购自南京建成生物研究所。

1.3 主要仪器

酶标仪、流式细胞仪（美国BIORAD公司）；RT-PCR仪（武汉新未来仪器技术有限公司）；BI-2000医学图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）；石蜡切片机（德国SLEE公司）；DYY-11型多用电泳仪、DYCZ-40B转印泳槽（北京六一仪器厂）。

1.4 实验方法 1.4.1 细胞培养、分组与给药

人骨肉瘤MG-63细胞株经常规解冻复苏后植入DMEM高糖培养基进行培养，取对数生长期细胞经0.25%胰酶消化、调整细胞浓度5×10⁴/mL后随机分为空白对照组、LP（5、10、20 μg/mL）组和顺铂（40 μg/mL）组，各组设10个复孔；各组细胞分别药物干预48 h后行各指标检测。

1.4.2 细胞生长状态的观察、细胞周期和细胞凋亡

状况的检测药物干预48 h后，通过倒置光学显微镜观察各组细胞生长状态并照相保存。各组细胞经PBS洗涤、70%乙醇5 mL混匀并置4 ℃环境48 h后离心取细胞，经PBS洗涤并打散细胞团后加5 μL水解酶Rnase（10 mg/mL），置37℃环境1 h，加入碘化丙啶染液，避光孵育30 min，然后通过流式细胞仪进行检测，采用CELL Quest软件分析各组细胞的细胞周期时相及凋亡状况。

1.4.3 细胞增殖抑制率的测定

调整细胞浓度至5×10⁴/mL，转移至96孔板，每孔滴加5 mg/mL MTT溶液20 μL后继续培养4 h、去上清液、加入DMSO 200 μL，常温下振荡处理10 min后通过酶标仪测定波长570 nm处吸光度（OD）值，计算公式：细胞增殖抑制率（%）=[1-（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）]×100%

1.4.4 细胞凋亡状况的观察

药物干预48 h后，各组细胞去上清液，经PBS溶液洗涤2次后，采用Hoechst 33342荧光染色法，通过倒置荧光显微镜观察各组细胞凋亡状况并拍照。

1.4.5 动物模型制备与分组

参照钱光等^[6]报道的方法制备荷人骨肉瘤裸小鼠模型：取实验用人骨肉瘤MG-63细胞经解冻复苏后植入DMEM高糖培养基进行培养，待细胞生长至对数生长期，收集至试管中离心（1 500 r/min，5 min）取细胞，加入适量PBS溶液制备细胞浓度为5×10⁶/mL的MG-63单细胞悬液，无菌条件下于背部皮下注射接种（0.2 mL，1×10⁶个细胞）MG-63细胞悬液制备荷人骨肉瘤裸小鼠模型。取100只模型裸小鼠随机分为模型对照组、LP[10、20、40 mg/（kg·d）]组和顺铂2 mg/kg组（n=20），腹腔注射给药，疗程14 d。

1.4.6 瘤体质量的称量及抑瘤率的计算

每组随机选取10只动物，颈椎脱臼处死后剖取肿瘤组织并称质量，计算抑瘤率：抑瘤率（%）=（模型组瘤质量-实验组瘤质量）/模型组瘤质量×100%

1.4.7 肿瘤组织形态结构变化和细胞凋亡状况的观察

取1.4.6称质量后瘤体组织，经4%多聚甲醛溶液中固定72 h、石蜡包埋、切片、脱蜡水化处理后，行常规HE染色后通过倒置光学显微镜观察肿瘤组织形态结构变化。石蜡切片经脱蜡水化处理后，采用TUNEL染色法、通过显微镜观察细胞凋亡状况；凋亡指数（AI）的计算：每张染色切片选取互不重叠的5个视野，分别计数视野中凋亡细胞数和细胞总数，各组分别取平均值，计算AI：AI（%）=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%

1.4.8 肿瘤组织bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达的检测

取各组剩余10只动物，剖取肿瘤组织研磨匀浆，4℃低温离心（12 000 r/min，10 min）取沉淀，采用BCA法测定蛋白浓度，蛋白变性（沸水浴加热5 min）、上样（每孔上样30 μg），经SDS-PAGE凝胶电泳后转PVDF膜、室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，滴加一抗（1:500）bcl-2、Bax、caspase-3、β-actin 4℃过夜，洗膜、二抗（1:100）室温孵育1 h后经ECL系统显影；以β-actin为内参，以条带灰度值测定bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达相对量并计算Bax/bcl-2比值。

1.5 统计学方法

运用软件SPSS17.0进行数理统计分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较，若方差齐采用LSD-t检验，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组细胞生长状况

如图 1所示：空白对照组人骨肉瘤MG-63细胞呈贴壁生长、增殖迅速，而LP组和顺铂组人骨肉瘤MG-63细胞呈现皱缩、脱壁、数量减少、细胞间接触松散等现象，其中以LP 20 μg/mL组最为显著。

2.2 各组细胞周期测定结果

与较空白对照组比较，LP 10、20 μg/mL组人骨肉瘤MG-63细胞周期G₀/G₁期均显著延长（P＜0.05，P＜0.01），S期和G₂/M期显著缩短（P＜0.05，P＜0.01）；顺铂组G₂/M期显著缩短（P＜0.01）；LP 20 μg/mL组G₀/G₁期较顺铂组显著延长且S期、G₂/M期显著缩短（P＜0.05）。见表 1。

2.3 各组细胞增殖抑制率检测结果

如表 2所示：较空白对照组，LP各剂量组和顺铂组人骨肉瘤MG-63细胞增殖抑制率均显著升高（P＜0.01）；且LP 20 μg/mL组细胞增殖抑制率显著高于顺铂组（P＜0.01）。

2.4 各组细胞凋亡状况的观察

经Hoechst 33342荧光染色后通过荧光显微镜观察，有亮蓝色荧光着色、胞质皱缩、形态变圆、体积变小的为凋亡细胞。结果如图 2所示：空白对照组仅可见极少量凋亡细胞，而LP各剂量组和顺铂组凋亡细胞数量较空白对照组明显增多，以LP 20 μg/mL组最为显著。

2.5 各组细胞凋亡率计算结果

经FCM分析，结果如图 3和表 2所示：较空白对照组，LP各剂量组和顺铂组人骨肉瘤MG-63细胞凋亡率均显著升高（P＜0.01），且LP 20 μg/mL组MG-63细胞凋亡率显著高于顺铂组（P＜0.01）。

2.6 各组裸小鼠瘤重和抑瘤率

结果如表 3所示：与模型对照组比较，LP[20、40 mg/（kg·d）]组和顺铂组瘤质量均显著减轻且抑瘤率均显著升高（P＜0.01），LP 40 mg/（kg·d）组瘤质量和抑瘤率与顺铂组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.7 各组荷骨肉瘤裸小鼠肿瘤组织形态结构变化

结果如图 4所示：模型对照组荷骨肉瘤裸小鼠肿瘤组织细胞呈椭圆形，胞质饱满，呈两个或多个胞核，核仁深染；LP各剂量组和顺铂组肿瘤组织细胞呈现皱缩、核染色质边集，呈现不同程度片状坏死，以LP 40 mg/（kg·d）组最为显著。

2.8 各组荷人骨肉瘤裸小鼠肿瘤组织细胞凋亡状况

经TUNEL染色并通过显微镜观察，如图 5所示：较模型组，LP各剂量组和顺铂组荷骨肉瘤裸小鼠肿瘤组织凋亡细胞数量明显增多，细胞凋亡状况以LP 40 mg/（kg·d）组最为显著；AI结果如表 4所示：与模型对照组比较，LP各剂量和顺铂组肿瘤组织细胞AI显著升高（P＜0.01），且LP 40 mg/（kg·d）组AI显著高于顺铂组（P＜0.01）。

2.9 各组荷人骨肉瘤裸小鼠肿瘤组织bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达

结果如图 6和表 5所示：较模型对照组，LP 20、40 mg/（kg·d）组和顺铂组bcl-2蛋白表达显著下调、Bax显著上调、Bax/bcl-2比值显著升高（P＜0.05，P＜0.01），且LP 40 mg/（kg·d）组Bax/bcl-2比值显著高于顺铂组（P＜0.01）；较模型对照组，LP 20、40 mg/（kg·d）组和顺铂组caspase-3蛋白显著上调（P＜0.01），且LP 40 mg/（kg· d）组caspase-3蛋白表达量显著高于顺铂组（P＜0.01）。

3 讨论

骨肉瘤患者每年新发约百万分之五^[7]，且多发于青少年，临床上主要采取早期截肢手术辅以术前术后化疗的治疗方案，但80%的患者因确诊时体内已经出现转移病灶而致使疗效不佳^[8]，5年生存率仅30%左右。因此，迫切需要以抑制骨肉瘤细胞生长为切入点研发新型的抗癌药物以及新的治疗方案。

番茄红素（LP）是一种具有广泛生物学活性的类胡萝卜素^[1-2]，近年来LP的抗肿瘤活性逐渐得到人们的关注，张玉江等^[3]等研究发现LP能够抑制人肺癌H520细胞的侵袭和迁移而抑制肺癌细胞的扩散；范现英等^[4]总结分析发现LP具有增强机体免疫力、诱导胃癌细胞凋亡的作用；此外，既往研究发现LP对人宫颈癌Hela细胞、人喉癌Hep-2细胞等均具有一定的抑制作用^[9-10]。本实验通过LP体外干预人骨肉瘤MG-63细胞进行研究发现，LP能够阻滞MG-63细胞周期于G0/G1期，提高增殖抑制率和凋亡率，从而抑制MG-63细胞生长并促进其凋亡。体内实验研究发现，LP能够抑制荷骨肉瘤裸小鼠肿瘤生长、提高抑瘤率；LP还能够诱导肿瘤组织坏死、促进肿瘤组织细胞凋亡。提示LP对体外人骨肉瘤MG-63细胞增殖和荷骨肉瘤裸小鼠肿瘤生长均具有一定的抑制作用。

细胞凋亡过程由多种基因参与调控，其中Caspase是激活各种凋亡刺激因子的关键蛋白酶，参与细胞凋亡凋亡过程的调节；bcl-2能够抑制线粒体破裂，可直接与多种凋亡刺激因子结合而抑制caspase-3激活，抑制促凋亡蛋白Bax细胞毒性作用，调节细胞内钙浓度，从而起到抑制细胞凋亡的作用^[11]；Bax具有诱导线粒体渗透性改变而释放细胞色素C、激活促凋亡蛋白caspase-9，表现出促细胞凋亡作用^[12]。此外，Bax能够与bcl-2聚合成二聚体，从而抑制bcl-2活性而促进细胞凋亡，所以Bax/ bcl-2比值更加能够体现Bcl-2基因家族对细胞凋亡的调控作用^[15]。本实验研究发现，经LP治疗能够有效上调荷骨肉瘤裸小鼠肿瘤组织caspase-3蛋白表达，下调bcl-2蛋白表达、同时上调Bax蛋白表达、提高Bax/bcl-2表达比值，并且LP 40 mg/（kg·d）组对caspase-3及Bax/bcl-2的调控作用均优于顺铂组，这可能是LP促进荷骨肉瘤裸小鼠肿瘤组织细胞凋亡而抑制肿瘤生长的重要分子机制之一。

综上所述，LP具有抑制体外人骨肉瘤MG-63细胞增殖、抑制体内骨肉瘤裸小鼠肿瘤生长的药理学作用；其机制可能与LP能够改变细胞周期，上调caspase-3蛋白表达，下调bcl-2表达、上调Bax表达而提高Bax/bcl-2比值有关。