溃疡性结肠炎（UC）是发生于结直肠的慢性非特异性炎症，病变在黏膜及黏膜下层，临床表现以腹痛、腹泻、黏液脓血便为主，病情轻重不一，并可发生皮肤、肝胆、骨关节、眼等器官并发症。近年来，随着生活水平的提高，饮食结构、生活习惯以及环境的变化，以及诊断技术的不断进步，溃疡性结肠炎在中国发病率逐年增高。且其病程较长，病情反复，治疗时间久，治疗难度大，已被世界卫生组织列为现代难治性疾病之一。

现代医学中UC的病因病机尚不明确，多认为与遗传、免疫、环境、感染等因素相关。目前研究认为UC活动性与肠黏膜上皮通透性增高，屏障功能降低^[2]关系密切。相关临床研究发现UC患者血液指标中的P-选择素可协助评估UC的炎症活动度。本实验拟观察化瘀通阳方药对UC模型大鼠肠黏膜通透性指标乳果糖/甘露醇值（L/M值）及P-选择素的影响，并探讨二者可能的关系。具体方法及结果如下。

1 材料与方法 1.1 动物与分组

选用42只体质量约170~190 g的雄性Wistar大鼠适应实验室环境（室温下20~25 ℃，相对湿度40%~60%，正常光照）及饮食4日后，用随机数字表法分为空白对照组12只、模型复制组30只。造模结束后将模型复制组大鼠用随机数字表法分为化瘀通阳、美沙拉嗪、模型对照3组，分别编号。

1.2 主要仪器和试剂

7890A型气象色谱仪、FID检测器、HP-5色谱柱（美国Agilent公司）、ELx800光吸收酶标仪（BioTek，美国）、电热恒温培养箱（Eppendorf，德国）、酶标板（Assay plate）（天津博泰亿达生物科技有限公司）、高速离心机（上海高创化学科技有限公司代理）、乳果糖标准品（含量96.0%）和甘露醇标准品（含量99.0%）（Biotopped公司）、超纯水（中国人民解放军卫生监测中心）、邻甲联苯胺、无水乙醇、冰醋酸（天津博泰亿达生物科技有限公司）、葡萄糖硫酸钠（DSS，美国MP公司，批号：M8667）。

1.3 实验药品

1）化瘀通阳灌肠方：由蒲黄10 g（产地：山东，批号：1312032），醋五灵脂10 g（产地陕西，批号1309128），薤白10 g（产地广西，批号：1310101）组成；由天津中医药大学第一附属医院药剂科提供，按照中药常规煎法制成相当于生药2.7 g/kg的药液，4 ℃冰箱保存备用。给药前配制成所需药物浓度，给药前置于定温为39~41℃的水浴锅中10 min后灌肠。2）美沙拉嗪灌肠液（莎尔福）：美沙拉嗪灌肠液（莎尔福，德国Falk药厂，15G58），用蒸馏水配成0.036 g/mL药液，给药剂量约0.4 g/kg（美沙拉嗪/大鼠体质量）。4 ℃冰箱保存备用。给药前先置于定温为39~41 ℃的水浴锅中10 min后灌肠。3）生理盐水：0.9% Nacl溶液（大连大冢制药有限公司），给药前先置于定温为39~41 ℃的水浴锅中10 min后灌肠。

1.4 动物模型制备

模型复制组每日予每只大鼠4 mL 5% DSS灌胃并自由饮用，进行UC模型复制。空白对照组大鼠每日自由饮用蒸馏水，正常喂食，共7 d。造模结束后，从空白对照组和模型复制组中各随机选取6只大鼠进行解剖取结肠病理标本，观察病例情况，判断造模情况。

1.5 给药方法 1.5.1

空白对照组，6只，治疗期间自由引用蒸馏水，正常喂食。模型对照组，8只，每日予2 mL 0.9%生理盐水保留灌肠治疗，每天1次，自由引用蒸馏水，正常喂食，共10 d。美沙拉嗪组，8只，每日予2 mL美沙拉嗪灌肠液保留灌肠治疗，每天1次，自由引用蒸馏水，正常喂食，共10 d。化瘀通阳组，8只，每日予2 mL化瘀通阳中药汤剂保留灌肠治疗，每天1次，自由引用蒸馏水，正常喂食，共10 d。灌肠方法，用10 mL注射器连接儿童一次性灌肠管，先将灌肠管插入大鼠肛门深度约为8 cm左右，接着开始注射药物进入肠道，边注射药物边后退灌肠管直到退出肛门，每只大鼠灌肠2 mL，灌肠后将大鼠倒挂安置于圆柱形洁净塑料瓶内15 min以保证灌肠液在肠道内停留的治疗时间，以防药物从肛门排出，15 min后将大鼠放回动物笼中。

1.6 样本留取检测

造模结束后，分别从空白对照组及模型复制组中选取6只大鼠，从目内眦静脉1 mL血液滴进柠檬酸钠抗凝管，慢速均匀摇动试剂管以保证血液与柠檬酸钠试剂混匀，从而达到抗凝效果，30 min内离心10 min（4 ℃、1 000×g），留取上清液，ELISA法检测P-选择素。尿液留取：以上大鼠排空膀胱，予乳果糖甘露醇混合溶液2 mL灌胃，2 h后分别予4 mL蒸馏水灌胃；收集6 h尿液；留尿期间大鼠均禁食，自由饮水。收集尿样经低温高速离心机离心30 min（4 ℃，离心力9 168×g），提取上清液，气相色谱分析法，检测L/M值。治疗结束后，模型对照组、美沙拉嗪组、化瘀通阳组所有大鼠按以上方法留取血液、尿液待检。

1.7 统计处理

数据采用SPSS 22.0统计软件包进行分析，计量资料符合正态分布的以均数±标准差（x±s）表示，两组比较采用两独立样本t检验，多组比较采用方差分析，两两比较时，若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 结肠组织大体评分结果

观察所取结肠组织，空白对照组大鼠结肠组织黏膜面光滑，纹理清晰，见图 1。模型复制组：肠腔内见血性内容物，剖开肠管见肠壁肿胀增厚、黏膜面紊乱、散在糜烂及溃疡面，见图 2。模型对照组，见图 3：组织色暗，腔内见血性内容物，局部水肿，散在粟粒样突起、散见溃疡形成。化瘀通阳组，见图 4：结肠组织接近空白对照组，局部色暗，黏膜较光滑、纹理较清晰，未见明显溃疡形成。美沙拉嗪组，见图 5：组织色泽接近空白对照组，肠管无明显水肿，粘膜光滑、纹理清晰、未见溃疡形成。

根据以下标准^[1]进行评分并拍照记录：没有溃疡，没有炎症，计0分；没有溃疡，局部充血，记1分；明显水肿，黏膜粗糙呈颗粒状，记2分；溃疡形成，最长溃疡≤1 cm，记3分；溃疡形成，溃疡最长径介于1~2 cm之间，记4分；溃疡形成，溃疡最长径≥2 cm，记5分；全段结肠肠壁坏死或大鼠死亡，记6分。

统计结果如下：美沙拉嗪组与模型对照组相比（P＜0.05），差异有统计学意义；化瘀通阳组与模型对照组相比（P＜0.05），差异有统计学意义；化瘀通阳与美沙拉嗪组相比（P>0.05），差异无统计学意义，结果见表 1。

2.2 L/M值结果

大鼠尿液L/M模型复制组与空白对照组比较，P＜0.05，差异具有统计学意义，结果见表 2。治疗后，尿液L/M值，美沙拉嗪组与模型对照组相比（P＜0.05），差异有统计学意义；化瘀通阳组与模型对照组相比（P＜0.05），差异有统计学意义；化瘀通阳与美沙拉嗪组相比（P>0.05），差异无统计学意义，结果见表 2。

2.3 P-选择素结果

模型复制与空白对照组相比，P-选择素浓度明显增高，P＜0.01，差异具有统计学意义。比较治疗后组间P-选择素浓度：美沙拉嗪组与模型对照组相比（P＜0.05），差异有统计学意义；化瘀通阳组与模型对照组相比（P＜0.05），差异有统计学意义；化瘀通阳与美沙拉嗪组相比（P＞0.05），差异无统计学意义，结果见表 3。

3 讨论

本实验采用葡聚糖硫酸钠法复制UC模型大鼠，模型复制组结肠组织评分、L/M值、P-选择素较空白对照组明显增高。结果表明，化瘀通阳方药可有效改善UC模型大鼠肠黏膜通透性并有效降低P-选择素浓度，与美沙拉嗪灌肠相比，疗效相当。

肠黏膜通透性是指肠黏膜被某些分子、物质以简单扩散的方式通过的性质。肠黏膜通透性的正常依赖于肠道机械屏障的完整性。肠黏膜机械屏障由肠道黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接、菌膜及黏液层等构成，是肠黏膜屏障中的重要组成部分，可阻止肠腔内的有害物质进入深部组织，维持着肠黏膜通透性的正常功能。溃疡性结肠炎活动期，多种促炎因子作用于上皮或内皮组织，损伤肠道机械屏障，改变着肠黏膜的完整性，影响着肠黏膜通透性。本实验采用乳果糖和甘露醇做示踪物来检测肠黏膜通透性。乳果糖作为大分子物质，通过肠黏膜上皮细胞间紧密连接吸收；甘露醇分子量为182，通过肠上皮细胞膜的水溶性微孔吸收；二者口服后不被机体代谢，以原形从尿液排泄^[2]，故检测尿液中含量可反映肠道吸收量，尿中二者的比值可以反应肠道通透性。UC状态下，肠黏膜可能发生萎缩，吸收面积减少，甘露醇通过减少，同时细胞旁通透性增加，降低了紧密连接蛋白Claudin和Occludin的表达，肠黏膜细胞间的紧密连接破坏，乳果糖通过增加，导致L/M值增加。多项实验表明测定L/M值可反映肠道通透性的改变^[3-5]。该实验结果模型复制组造模后L/M值较造模前明显增高，提示溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜受损、通透性增高。治疗后美沙拉嗪组及化瘀通阳组L/M值明显低于模型对照组，说明二者对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜通透性有改善作用，而生理盐水对其无明显改善作用。

P-选择素为细胞黏附分子中选择素成员之一，又称颗粒膜糖蛋白或血小板活化依赖性颗粒表面膜蛋白，合成并储存于静息血小板的α颗粒膜上以及内皮细胞的Weibel-Palade小体中。P-选择素一般认为有2种来源：第一种是在血小板受到组织胺、凝血酶、佛波酯和钙离子载体的刺激后被激活分泌至血浆，第二种是由内皮细胞的释放。近年来研究表明IBD的活动期存在内皮细胞的损伤和血小板的活化^[6]，P-选择素主要表达于活化的血小板和内皮细胞的表面，它是介导白细胞游出血管的主要黏附分子之一，并与多种炎性细胞的活化和浸润有着密切的联系。研究发现黏附分子介导的白细胞-血小板、白细胞-内皮细胞的相互作用，是引起炎症反应，血栓的形成和造成组织损伤的关键因素。现代研究表明P-选择素是启动早期炎症反应的重要分子，也是血小板活化的金标准以及内皮细胞活化的重要指标^[7]，P-选择素通过介导中性粒细胞和单核细胞在内皮细胞上的滚动和黏附，在炎症的发生发展中起重要的作用^[8]。

各种促炎因子通过不同的通路引起Fax/Fasl表达增高促使上皮细胞凋亡^[9]、抗杯状细胞抗体出现使得粘蛋白分泌减少^[10]，且粘蛋白呈低硫酸化对细菌侵袭的抵抗能力减弱^[11]。同时，炎症因子影响紧密连接蛋白的表达、结构及功能，影响着细胞旁通路的通透性。多种因子综合作用下，引起肠黏膜通透性的增高。而肠黏膜通透性的增加使得细菌、内毒素等进入循环系统，并引发炎症活动，该过程中，可能产生了刺激血小板生成因子，并加快血小板活化，同时炎症因子对内皮细胞的损伤，二者共同引起P-选择素的分泌和释放增多。而P-选择素的增多进一步启动和介导炎症反应，并促使血栓形成，肠黏膜炎症、缺血进一步加重，黏膜损伤形成溃疡。二者相互作用，形成恶性循环，推进着UC的发生发展。

化瘀通阳方主要以薤白，蒲黄，五灵脂三味药物配伍而成，从而起到活血化瘀，宣通卫阳的功效。卫气属阳，生于水谷精气，源于脾胃，能卫外而护腠理。中医认为“初病在气，久病则有瘀”。溃疡性结肠炎病程间歇发作，缠绵难愈，久病必虚，则会导致瘀血阻络，又因为其病位在肠道，肠络受损致瘀则出现瘀血及排出脓血便。薤白有抗菌、抗氧化^[12]、抑制血小板聚集的作用。蒲黄中总黄酮类和有机酸类成分具有抑制血小板聚集功能^[13-14]，且有抗氧化作用，能促进损伤细胞的恢复^[15]。五灵脂含有多量树脂、尿素、尿酸及维生素A类物质等。五灵脂有抗炎作用^[16]，五灵脂乙酸乙酯提取物可以显著降低炎症组织的前列腺素E（PGE）含量。且蒲黄、五灵脂均可扩张血管，增加血流量，改善血液循环^[17]，促进肠道炎症恢复，并具有提高机体免疫力，抗缺氧，抗炎止痛作用，可以降低全血黏度、血浆粘度，延长凝血剂血栓形成的作用^[18]。各种作用共同起到促进黏膜愈合，改善肠粘膜通透性，降低P-选择素浓度的作用。同时，薤白、蒲黄^[19]、五灵脂^[20]均可以缓解平滑肌痉挛，有明显镇痛作用，缓解腹痛症状，有利于疾病的缓解。