近年来，缺血性心脏病越来越趋于年轻化，每100人中就有5人为年轻人，随着治疗缺血性心脏病手段的不断进步，使许多组织器官缺血后重新得到血液再灌注供应。多数情况下，缺血后给予灌注可使组织器官以及结构得以恢复正常功能，但有时缺血后再灌注，不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重其组织、器官的功能障碍和结构损伤，这种不可逆性损伤的现象称为缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury）^[1]，这种病理性损伤已成为如今研究的热点话题之一。其中以补气药黄芪的研究最为热门，毛蕊异黄酮为黄芪中有效成分之一。在中医学研究中，并无心肌缺血再灌注损伤疾病，但据其病位及胸闷、胸痛等临床表现中医学家将心肌缺血再灌注损伤归属于“胸痹”“心悸”的范畴。治疗心肌缺血再灌注首先应改善因痰瘀而阻痹心脉，导致心脉气机不通，心肌在缺血后进行再灌注时，短时间内恢复供血供氧可以使血液运行通畅，相当于“破血”，而“破血”将会进一步对机体的气血造成更为严重的损伤，使血瘀加重并伴有脏腑之气不足。血瘀为其基本病机，在治疗过程中当重视活血化瘀，兼顾他症，以图标本兼治^[2-3]。其中以补气药黄芪的研究最为热门，在《神农本草经》中记载为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，为植物和中药材的统称。毛蕊异黄酮为黄芪中有效成分之一，因此本研究开展毛蕊异黄酮对心肌缺血再灌注损伤的保护作用机制研究。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要仪器与试剂

Powerlab/8sp离体心脏灌流系统，全自动生化仪，毛蕊异黄酮对照品，购自中国食品药品检定研究院，CK、LDH试剂盒及其他试剂购自天津富汇科技有限公司。

1.1.2 实验动物

SPF级雄性SD大鼠（320±20）g，购自北京维通利华生物科技股份有限公司，合格证号：SCXK（京）2012-0001。

1.2 方法 1.2.1 Langendorff离体心脏缺血再灌注模型的制备

腹腔注射5%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉后取心脏置于Krerbs-Henseleit（K－H）缓冲液中，经主动脉插管悬挂于Langendorff装置，实时监测心功能参数。

1.2.2 实验分组

将雄性SD大鼠随机分成3组，每组8只，方法如下：正常对照组（Control）：离体心脏在Langendorff装置上持续灌流80 min；模型组（IR）：K-H缓冲液平衡30 min后，全心停灌缺血20 min，再灌注30 min；毛蕊异黄酮0.1 μmol/L剂量组均在K-H缓冲液平衡20 min后，预给药10 min，再全心停灌缺血20 min，再灌注30 min。

1.2.3 冠脉流量（CF）、心功能参数（LDH）的检测及CK、LDH活力测定

分别记录冠脉流量CF（mL/min）、左室收缩压（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）、心率（HR），计算左室内压最大上升/下降速率的变化率（%）。收集冠脉流出液并用全自动生化仪测定冠脉流出液中CK、LDH的活力。

1.2.4 心肌梗死面积的计算

分别取各组心脏，横行切取3 mm厚度心脏切片，用磷酸盐缓冲液配制成1%的TTC染色液，将组织置染色液中，取出组织，并用Image J软件计算梗死面积。

1.2.5 丙二醛（NDA）、超氧化物歧化酶（SOD）以及琥珀酸脱氢酶（SDH）活力测定

用10%组织匀浆液，95 ℃水浴40 min，取出后冷却，以3 500~4 000 r/min，离心10 min，取上清100 μL，按照说明书检测。

1.2.6 Wstern-blot及RT-PCR方法研究毛蕊异黄酮抗氧化的相关通路

取左室心肌组织，超声破碎，测定蛋白浓度，将总蛋白电泳，转膜，洗涤，接着孵育anti-Nrf2抗体和anti-GAPDH抗体，在4 ℃条件下过夜。二抗孵育1 h，洗涤，发光液显色，用凝胶成像系统照相扫描对其灰度值进行分析。

1.3 统计方法

实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析方法（One-Way ANOVA），组间两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 毛蕊异黄酮对大鼠离体心脏冠脉流量的影响

见图 1。由图 1可知，与正常对照组相比，各组的冠脉流量均随再灌时间的延长而逐渐减少。其中，I/R组的冠脉流量在再灌注初期就出现统计学差异（P＜0.01）；且毛蕊异黄酮组能改善冠脉流量，且作用显著（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 毛蕊异黄酮对大鼠离体心脏心功能各项参数的影响

见图 2。由图 2可知，与正常对照组相比，模型组能显著降低大鼠离体心脏的左心率（HR）及最大上升/下降速率的变化率，给予毛蕊异黄酮后能显著改善由于缺血再灌注损伤引起的上述指标的降低，且作用明显（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 毛蕊异黄酮对大鼠离体心脏冠脉流出液中CK、LDH活力的影响

见图 3。由图 3可知，各组的CK、LDH均在再灌注初期明显升高，且在再灌注10-20min内达到峰值，尤其模型组升高的最为明显（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组相比，毛蕊异黄酮组能降低冠脉流出液中CK、LDH的活力，明显的趋势。

2.4 毛蕊异黄酮对大鼠离体心脏梗死面积的影响

见图 4。由图 4可知，与模型组相比，各给药组大鼠离体心脏梗死面积均有明显减少（P＜0.01），毛蕊异黄酮组能显著降低大鼠离体心脏梗死面积（P＜0.05）。

2.5 毛蕊异黄酮对大鼠心脏组织中SOD、MDA、SDH活力的影响

见表 1。由表 1可知，与正常对照组相比，模型组SOD、SDH明显降低，MDA显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组相比，毛蕊异黄酮组能显著增加SOD、SDH活性（P＜0.01），降低心脏组织中MDA含量。

2.6 毛蕊异黄酮对缺血再灌注损伤诱导的Nrf-2及HO-1等蛋白表达的影响

见表 2。如表 2所示，与对照组相比，缺血再灌注损伤会上调Nrf-2\HO-1，p-Akt/Akt蛋白水平，给药预处理后使Nrf-2\HO-1，p-Akt/Akt与p-ERK/ERK显著下降，有统计学差异（P＜0.01），可能是激活Nrf-2/HO-1通路发挥抗氧化作用。

3 讨论

机体在逆境下遭受外界刺激与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关，形成脂质过氧化的产物。如MDA以及氧自由基等。氧化应激是指机体组织或细胞内氧自由基增多和（或）清除能力降低导致活性氧在体内或细胞内蓄积而引起氧化损伤的过程。氧自由基是细胞呼吸产能过程中的产物之一，在心肌缺血再灌注开始后大量生成，其可引起脂质过氧化，细胞能量产生异常和离子稳态失衡，从而导致细胞损伤甚至死亡。氧化应激产生的氧自由基活性氧（ROS）直接或间接地损伤组织内脂质、蛋白质、核酸等大分子物质的生理功能，是众多疾病发生的病理生理学基础。机体自身形成了一套较为复杂的氧化应激应答系统，当活性氧刺激或暴露于亲电子基团时，能诱导激活一系列的保护性蛋白，以缓解组织损伤。因此，清除自由基是保护心肌组织免受损伤的关键的机制之一。

大量实验也证实^[2-4]，毛蕊异黄酮，具有清除自由基，抗氧化损伤的活性。在上述研究的基础上，针对氧化应激在缺血再灌注损伤中的关键作用，随着对Nrf2-ARE信号通路分子机制的不断深入认识研究及其对生理病理意义的进一步探讨，越来越多人重视Nrf2-ARE信号通路在人体中的作用。本研究通过Langendorff离体心脏灌流装置以及结扎心脏冠状动脉左前降支造成心肌缺血再灌注模型，分别从心功能、心肌酶学、病理学检测（TTC）等方面阐述了毛蕊异黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的心功能保护作用；采用Western Blot方法检测毛蕊异黄酮对氧化应激状态下的Nrf2、HO-1、AKT、ERK蛋白的表达影响。本研究考察了毛蕊异黄酮对缺血再灌注损伤诱导的氧化应激的影响，并初步探讨了其作用的相关机制及作用靶点。通过氧化应激在心肌缺血再灌注损伤中有着重要作用，基于氧化应激通路考察了毛蕊异黄酮对其的保护作用机制。结果证实毛蕊异黄酮能够降低由缺血再灌注损伤诱导心肌组织中的MDA含量的升高及增加SOD、SDH等抗氧化酶的活力。

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