独活为当归属（AngeIica L.）伞形科植物重齿毛当归（Angelica pubescensMaxim. f. biserrata Shan etYuan）的干燥根及根茎, 被誉为治疗风湿痹痛“第一要药”，具有祛风除湿、通痹止痛功效，临床上主要用于治疗风寒湿痛，腰膝疼痛、少阴伏头痛、风寒挟湿头痛^[1]。15版药典中以蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯作为独活质量控制的主要指标。独活中的蛇床子素^[2-4]、补骨脂素^[5]、花椒毒素^[6-7]、伞形花内酯^[8]具有抗肿瘤活性，欧前胡素和异欧前胡素具有抗炎镇痛的作用^[9]，这些重要的活性成分对于独活的质量控制和深入研究有着重要的意义。本课题组前期建立了独活总香豆素、6种香豆素含量和一种倍半萜衍生物类含量分析方法^[10]。随着独活主要成分的分析方法^[11-13]及其药理活性^[14-16]不断深入研究，二氢欧山芹醇的药理作用越来越受到了关注。现代研究表明二氢欧山芹醇具有抑制血小板聚集、抗脂质过氧化^[17]、抑制组织胺释放^[18-19]、抑制病毒基因组的活化与拉吉细胞的生存^[20]、抗炎^[21]作用和抗病原体的效应^[22]。二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷具有比较强的抑制大鼠血小板体外聚集效应的作用^[23]。二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷在体内可能代谢为二氢欧山芹醇^[24]。因此，本研究拟筛选独活中二氢欧山芹醇和二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷最佳提取条件，建立同时测定独活中二氢欧山芹醇和二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷含量的HPLC方法，为不同产地独活质量控制评价和合理开发利用提供科学依据。

1 材料和试剂 1.1 仪器

Agilent technologies 1200高效液相色谱仪；Agilent technologies6560 Accurate-Mass Q-TOF LC-MS），SB-1000YDTD超声清洗系统；万分之一天平（德国赛托利斯公司）；离心机（德国Sigma公司）；十万分之一电子天平（METTLER TOLEDO），MILLI-Q超纯水系统（Millipore公司，Mill-QⅡ型）。

1.2 试剂

二氢欧山芹醇，二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷对照品（均在我们实验室通过经典的硅胶柱色谱分离得到，纯度检测通过Agilent technologies 1200高效液相色谱仪，鉴定通过Agilent technologies6560 Accurate-Mass Q-TOF LC-MS，纯度均大于98%），乙腈（色谱纯，天津市康科德科技有限公司），甲醇（分析纯，天津市康科德科技有限公司），二十批独活药材粉末（来自于全国不同省份）。

1.3 色谱条件

色谱柱：Hedera ODS-2（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B）；流速：1 mL/min；柱温为30 ℃，进样量10 μL，洗脱程序如下：0~5 min，20%~23%A；5~8 min，23%~40%A；8~10 min，40%~41%A；10~12 min，41%~43%A；12~13 min，43%~48%A；13~14 min，48%~50%A；14~16 min，50%~51%A；16~18min，51%~51%A。

1.4 对照品溶液的制备

分别精密称取二氢欧山芹醇和二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷5.0 mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配制1 mg/mL的标准品母液。通过计算，用甲醇稀释配置不同浓度对照品混合溶液，置于4 ℃冰箱备用。

1.5 样品溶液的制备

精密称取不同产地的独活药材粉末0.1000 g，置于锥形瓶中，加入5 mL甲醇，称重，超声（功率99%，频率40 Hz，温度30 ℃）提取60 min，补足失重，140 000 r/min离心，取10 μL进样分析。

2 结果与讨论 2.1 最佳提取条件的优化

本研究采用单因素分析的方法，分别考察了超声时间（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min）、提取溶剂甲醇的浓度（50%，75%和100%）和提取溶液的体积（5 mL，10 mL，20 mL，40 mL）对两种化合物的提取能力的影响，结果表明随着超声时间的增加，呈现先增加后变低趋势，在超声60 min时，提取率最高；随着提取溶剂浓度增加，提取率呈现上升趋势，在100%甲醇做提取溶剂时，提取率最高；随着提取容积体积增大，两种化合物的提取率呈现下降趋势，在5 mL提取溶剂提取时，提取率最高。综合上述的实验结果，5 mL 100%甲醇超声提取60 min为最佳的提取条件。

2.2 方法学考察 2.2.1 标准曲线、线性范围、LOQ、LOD

配制不同浓度的混合标准品溶液，进入HPLC，记录不同浓度下两种化合物的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，获得得回归方程（表 1）。从结果可知两种化合物在0.40~20.00 μg/mL范围内，线性关系良好。两种化合物的LOQ均为0.15 μg/mL。

2.2.2 精密度

按照样品提取条件，提取的独活样品（湖北-2）制备供试品溶液，连续进样6次，记录所测化合物的峰面积，计算所测化合物的含量及其RSD值，结果显示二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷和二氢欧山芹醇的RSD值分别为1.20%和1.56%，表明此方法精密度良好。

2.2.3 重现性

按照样品制备方法，提取6份独活样品（湖北-2）制备供试品溶液，进样，记录所测化合物的峰面积，计算两种化合物的含量的RSD值。二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷和二氢欧山芹醇，分别为0.57%和0.94%，表明此方法重复性较好。

2.2.4 稳定性

取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12，24 h进样，记录二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷与二氢欧山芹醇的峰面积，结果表明二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷和二氢欧山芹醇分别为2.64%和2.29%，表明2种化合物在室温下24 h较稳定。

2.2.5 加样回收率

精密称取0.050 0 g独活样品（湖北-2）6份，加入等量的两种化合物，按照样品溶液制备方法制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率，结果表明二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷和二氢欧山芹醇加样回收率分别为99.0%和102%，其RSD分为2.99%和2.59%。

2.3 样品测定

利用所建立的HPLC分析方法和最佳提取条件，对不同产地的独活药材中二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷与二氢欧山芹醇含量进行了测定，结果见表 3。从图 1可知，二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷与二氢欧山芹醇分离度良好，药材中其他成分对其测定无影响。从表 3可知不同地区独活样品中二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷与二氢欧山芹醇含量存在较大的差异；即使相同的产地，二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷与二氢欧山芹醇含量也存在一定差异，可能与其气候条件、采收时间、生育期等多种因素有关。

3 结论 3.1

以二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷与二氢欧山芹醇的提取率为指标，优化了独活最佳超声波提取的条件，确定以料液比1：50，用100%甲醇超声提取60 min，二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷和二氢欧山芹醇的提取率最高，可用于从独活中提取二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷和二氢欧山芹醇两种活性成分。

3.2

本研究建立了同时测定独活中二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷与二氢欧山芹醇的高效液相法，此方法具有操作简单、稳定可靠、重复性好等特点，可用于不同产地独活药材二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷与二氢欧山芹醇含量测定，为独活药材资源开发利用提供科学依据，为合理的质量评价方法的建立提供了技术支撑。