升麻葛根汤首载于宋代钱氏门人阎孝忠的《阎氏小儿方论》，后被收载于《太平惠民和剂局方》中，最早流行于宋代，对后世影响深远的经典名方。本方由升麻2 g，葛根3 g，白芍2 g，炙甘草2 g 4味中药组成，具有辛凉解肌，透疹解毒的功效。主治麻疹初起，疹发不出，身热头痛，咳嗽，目赤流泪，口渴，舌红，苔薄而干，脉浮数等。方中升麻味辛、甘，性寒，入肺、胃经，解肌透疹，清热解毒为君药；葛根味辛、甘，性凉，入胃经，解肌透疹，生津除热为臣药；白芍益阴和营，以防君臣升散太过，为佐药；使以炙甘草调和药性。四药配伍，共奏解肌透疹之功^[1]。

现代药理研究表明，升麻中的苯丙酸类成分如异阿魏酸、阿魏酸和咖啡酸等，是升麻清热解毒的有效部位，临床上常用于治疗麻疹、水痘、带状疱疹、流感等^[2]。异黄酮类化合物是葛根的主要成分, 主要有葛根素、大豆苷、大豆苷元等，其中葛根素不仅为葛属植物特有成分，而且还是葛根中含量最高、活性最强的异黄酮类化合物^[3]。白芍总苷是白芍的主要有效部位, 其中芍药苷占总苷量的90%以上，是白芍的主要有效成分，具有抗炎、止痛、保肝和调节自身免疫等多种药理作用^[4]。故本研究选用异阿魏酸、葛根素和芍药苷为含测指标，这3个主要活性成分分别作为君药、臣药和佐药的主要评价指标成分，可以在一定程度上评价该复方的临床疗效。

1 仪器与材料 1.1 实验仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，配备G1310A型HPLC四元泵、G1314B VWD检测器，Agilent ChemStation工作站；十万分之一电子分析天平（XP205，瑞士METTLER TOLEDO公司）；台式通用冷冻离心机（美国Thermo Fisher公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。

1.2 实验材料

升麻（黑龙江，批号15022403，衢州南孔中药饮片有限公司）；葛根（安徽，批号150201，浙江中医药大学饮片有限公司）；白芍（安徽，批号15030303，衢州南孔中药饮片有限公司）；炙甘草（新疆，批号20150302，珠海李氏百草饮片有限公司）；以上药材经安徽中医药大学刘守金教授鉴定，升麻为毛茛科植物兴安升麻Cimicifugahera-cleifoliaKom.的干燥根茎，葛根为豆科植物野葛Puerarialobata（Willd.）Ohwi的干燥根，白芍为毛茛科植物芍药Paeonialactiflora Pall.的干燥根，甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根茎。异阿魏酸（批号111698-201103，纯度99.2%）；芍药苷（批号110736-201136，纯度96.0%）；葛根素（批号110752-201418，纯度95.5%）均购于中国药品生物制品鉴定研究院。磷酸二氢钾（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20150504）；甲醇（色谱纯，Fisher Chemical，批号153201）；水（超纯水，实验室自制）。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

Waters XBridge® Shield RP18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）-0.05 mol/L磷酸二氢钾（B），梯度洗脱（见表 1），体积流量为0.8 mL/min，双波长检测，检测波长为230 nm和317 nm，柱温30 ℃，进样量5 μL。在上述色谱条件下，理论塔板数以葛根素峰计不低于5 000。

2.2 对照品溶液和供试品溶液的制备 2.2.1 混合对照品溶液的制备

取异阿魏酸、芍药苷、葛根素适量，精密称定，用甲醇配制成每1 mL含异阿魏酸0.04 mg、芍药苷0.5 mg、葛根素0.6 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备

取升麻葛根汤水煎液适量，以12 000 r/min离心10 min，取上清液，即得。分别取缺升麻、白芍、葛根、炙甘草的阴性煎液，以相同方法制备得到的溶液，作为阴性供试品溶液。

2.3 专属性考察

照“2.1”项下色谱条件，分别取“2.2”项下的混合对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液和空白溶剂（水）注入液相色谱仪，各个指标在对照品保留时间相同的位置，均有相应的色谱峰出现且阴性无干扰，本方法专属性良好。

2.4 线性关系的考察

精密称取芍药苷对照品9.56 mg、葛根素对照品20.02 mg、异阿魏酸对照品5.09 mg，分别置于10 mL、10 mL和50 mL容量瓶中，用甲醇超声溶解并定容至刻度，摇匀。精密吸取上述芍药苷对照品溶液1 mL、葛根素对照溶液2 mL和异阿魏酸对照溶液2 mL于5 mL容量瓶中，摇匀，即为线性混合对照品溶液。

按2.1项下色谱条件，分别精密吸取线性混合对照品溶液2、4、6、8、10、16和32 μL注入液相色谱仪，以进样体积（X，μL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，得回归方程Y=108 577X-53879（R²＝1），Y=989 562x+106 886（R²＝0.999 9），Y=81 877X-11 705（R²=0.999 8）。结果表明，芍药苷在0.382~6.118 μg，葛根素在1.602~25.626 μg，异阿魏酸在0.081~1.303 μg范围内具有良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液5 μL，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，测得芍药苷、葛根素和异阿魏酸峰面积的RSD%（n=6）分别为1.7%、1.8%和1.7%，，结果表明，仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

按2.2.2项下供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品溶液，分别进样5 μL，记录色谱图，测得芍药苷、葛根素和异阿魏酸峰面积的RSD%（n=6）分别为1.8%、1.7%和1.9%。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、16、24、36、48 h时间点进样5 μL，测得芍药苷、葛根素和异阿魏酸峰面积的RSD%（n=6）分别为2.3%、0.7%和3.9%。

2.8 加样回收率实验

精密量取25 mL升麻葛根汤煎液置于50 mL的容量瓶中，一式6份，备用；每份分别精密加入芍药苷对照品4.5 mg，葛根素对照品11.0 mg，精密量取异阿魏酸溶液1 mL加入（异阿魏酸溶液配制：精密称取4.5 mg异阿魏酸置于10 mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解，定容至刻度，摇匀，即得），加甲醇适量，超声溶解，用甲醇定容至刻度，摇匀，取适量12 000 r/min离心10 min, 取上清液，即得。在“2.1”项色谱条件下，分别进样5 μL进行测定并计算回收率。结果见表 2，其中芍药苷、葛根素和异阿魏酸的平均回收率（n=6）分别为101.5%、102.9%和98.1%；RSD%（n=6）分别为2.6%、2.2%和2.8%。

2.9 样品测定

取样品按2.2.2项下供试品的制备方法制备3份供试品溶液，按2.1项色谱条件下分别进样分析，按外标法计算3个指标成分的单处方含量，结果见表 3。

3 讨论

升麻葛根汤制剂含量测定有关文献有文献^[5]运用HPLC法，以甲醇-乙腈-[1.6%冰醋酸的1.0 mol/L醋酸铵溶液]（12：7：81）为流动相测定升麻葛根汤中异阿魏酸、阿魏酸、咖啡酸和葛根素的含量。郭珉^[6]等采用RP-HPLC法，用等度洗脱且同时变换流速和波长的方法测定了复方升麻颗粒中异阿魏酸、葛根素和芍药苷的含量。但就升麻葛根汤而言，采用同一色谱条件同时测定异阿魏酸、葛根素和芍药苷3种主要活性成分含量尚未见报道。本实验运用HPLC法，在230 nm下，以梯度洗脱的方式同时测定上述3种有效成分的含量，方法简便易行、准确度高、稳定性和重复性好，为升麻葛根汤的质量评价提供了一种可行的方法。

色谱条件的选择本试验于200~400 nm下对混合对照品溶液进行了DAD光谱扫描，结果发现芍药苷、葛根素和异阿魏酸的最大吸收波长分别为230、250和317 nm。当检测波长为230 nm时，芍药苷和葛根素均有较好的吸收，异阿魏酸虽有一定吸收，但其在317 nm下吸收强度最大。又因葛根素和异阿魏酸出峰时间较为接近，若采用切换波长的话可能会影响到异阿魏酸的色谱峰，故本方法采用双波长检测法，分别在230 nm和317 nm下测定。研究中发现芍药苷、葛根素色谱峰在相同色谱条件下色谱行为往往较一致，两者保留时间较接近，采用乙睛-水系统很难将两者分离，因此选择甲醇-水系统，并考察不同品牌的C18色谱柱，结果表明Waters XBridge® Shield RP18色谱柱色谱峰分离较佳；同时研究中发现芍药苷色谱峰拖尾严重，分别考察了水相为0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液、0.2%醋酸溶液、0.1%磷酸溶液以及磷酸氢二钾-磷酸缓冲盐溶液等流动相，最后优选水相为0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液。

升麻葛根汤药物及有效成分的研究现代中医临床中，升麻葛根汤被广泛用于内、外、五官等多科疾病，如流行性感冒、荨麻疹、带状疱疹、水痘、病毒性肠炎、急性肠炎、细菌性痢疾、肺炎、病毒性肝炎、鼻窦炎、中耳炎、痤疮等细菌或病毒等感染及发热性疾病的治疗。方中升麻主要有三萜及其苷类和有机酸类，其中有机酸类如阿魏酸、异阿魏酸和咖啡酸等，是升麻抗炎、镇痛、解热的主要活性成分^[2]。挥发油中的棕榈酸^[9]，有抗菌、消炎的功效，总酚酸是其治疗乙型病毒性肝炎的药用活性部位^[10]；升麻还具有抑制呼吸道病毒（流感病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒）作用^[11-12]。葛根在中医临床中治疗表证发热、头疼项强、斑疹不透、脾虚泄泻及消渴的要药^[13]。其中葛根素有降低血压、减缓心率、抑制动脉硬化、改善微循环、抗肿瘤、抗氧自由基、解酒、神经组织保护等作用^[14]，在临床上应用于抗心律失常的治疗^[3]，其机理可能是通过改变细胞膜对钾、钠、钙离子的通透性而降低心肌兴奋性^[15]、抑制外向整流K+电流完成的作用^[16]。白芍主要有效成分：主要有萜类、黄酮类、鞣质类、酚类、挥发油类和糖类等化合物。萜类为白芍的主要活性部位，多以糖苷类形式存在^[17]，其中白芍总苷具有镇痛、抗炎、保肝，以及多途径抑制自身免疫反应等多种药理作用，对类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身兔疫病有确切疗效^[18]，其镇痛作用可能由内源性阿片受体介导^[19]。炙甘草主要含有三萜皂苷类、黄酮类、香豆素类、多糖和生物碱以及氨基酸等成分^[20]。现代药理学研究表明^[21]，甘草具有抗炎保肝、抗菌、抗病毒、镇咳、抗疟，抗氧化、抗肿瘤、免疫调解、降糖和抗血小板凝集等多种活性。