2017, Vol. 34文章信息
- 王琦妙, 金明, 潘琳, 项占梅, 秦亚丽
- WANG Qi-miao, JIN Ming, PAN Lin, XIANG Zhan-mei, QIN Ya-li
- 利用清热明目方超声雾化法干预兔眼结膜炎模型的实验研究
- Experimental research on conjunctivitis treated with Qingre Mingmu decoction by ultrasonic atomization method
- 天津中医药, 2017, 34(6): 407-410
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2017, 34(6): 407-410
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2017.06.15
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文章历史
- 收稿日期: 2017-03-20
清热明目方主要由黄芩、金银花、鱼腥草、薄荷等中药组成。全方疏风散邪止痒, 清热解毒退翳。临床治疗中笔者发现, 清热明目方经超声雾化法治疗急性结膜炎能够较快的改善患者症状。为进行深入研究, 设计实验并探讨利用清热明目方超声雾化法对兔眼结膜炎模型的治疗作用[1-4]。
1 材料 1.1 动物日本大耳白兔, 体质量2~2.5 kg, 雌雄各半, 无眼疾。由北京大学医学部实验动物部提供, 许可证号:SYXK (京)2011-0039, 普通级, 饲养于北京大学医学部实验动物部SPF级动物实验室, 实验室环境温度为21~23 ℃, 相对湿度为55%~60%。
1.2 药品和试剂 1.2.1 清热明目方每袋100 mL, 中日友好医院中药调剂科煎药室提供。药方经全方提取、常温静置、过滤、离心, 取上清液与薄荷等药物提取液混合而成。
1.2.2 左氧氟沙星滴眼液国药准字J20100046, 规格:每支5 mL, 每5 mL含左氧氟沙星24.4 mg; 批号:CV1404;参天制药(中国)有限公司。
1.2.3 刺激剂斑蝥酊, 10 g/L, 中日友好医院临床研究所实验室自配。
1.3 仪器粤华超声雾化器WH-2000, 广东粤华医疗器械厂有限公司提供。
2 方法 2.1 造模与分组取无眼疾的日本大耳白兔24只, 单笼饲养, 分别编号, 随机取出6只作为正常组, 余下18只动物每只兔眼用微量进样器分别滴入斑蝥酊50 μL, 每天1次, 连续3 d, 末次刺激后30 min, 观察动物的反应及结膜炎症情况, 确定造模成功。将18只造模成功的动物按照随机数字表法随机分为模型组、阳性对照组、清热明目组。
2.2 给药正常组及模型组不干预; 阳性对照组用左氧氟沙星滴眼液滴左眼每天4次, 每次1滴; 清热明目组用注射器将清热明目煎液20 mL注入雾化器容器中, 用雾化管连接塑料喷嘴, 喷雾口正对兔左眼(兔被兔盒固定), 开睑器撑开左眼眼睑接受治疗, 通过超声振动使药液形成雾化分子到达球结膜, 喷雾口和角膜距离为2~3 cm, 开机定时20 min, 每天1次; 阳性对照组及清热明目方治疗组家兔右眼作为自身对照, 不做干预。连续给药9 d。
2.3 结果分析末次治疗24 h后麻醉过量致死, 每只动物取左眼结膜并用10%甲醛固定、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色, 进行病理组织学观察。在40倍光学显微镜下, 对毛细血管扩张充血和炎细胞浸润两方面进行评分, 评分标准参照结膜刺激反应的表现[5], 根据程度从轻到重分为4级, 分别记为0、1、2、3分。
对切片进行免疫组织化学染色观察IL-1β、IL-6、TNF-α在兔眼结膜的表达情况, 免疫组化标本在光学显微镜下观察、拍照, 由于切片数量较少, 对其进行了定性分析, 而未能进行统计学计量分析。
2.4 统计学方法对评分结果进行统计分析, 各组数据用均数±标准差(x±s)表示, 用SPSS 19.0软件做统计分析, 各组数据进行单因素方差分析, P＜0.05为差异有统计学意义。
3 结果 3.1 清热明目方对兔眼结膜炎模型影响的肉眼观察情况实验时, 发现兔眼滴入自制斑蝥酊后均呈现出闭眼, 躁动等痛苦症状。治疗前除正常组外, 各组动物均出现明显的炎症反应, 造模成功。表现为:眼睑痉挛(眨眼次数增加)、结膜充血、水肿、分泌物增多, 睫毛湿润、黏着等。
3.2 病理组织学检查对各组动物眼结膜组织镜下观察扩张充血及炎细胞浸润程度进行分析, 结果见表 1, 图 1。
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| 图 1 结膜炎症反应的程度(HE, 40×) Fig. 1 Degree of inflammation in conjunctiva (HE, 40×) A:正常组; B:模型组; C:阳性对照组; D:清热明目组 |
病理组织学观察清热明目组、阳性对照组分别与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05), 清热明目组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
3.3 清热明目方经超声雾化法治疗对兔眼结膜细胞因子的影响 3.3.1 清热明目方经超声雾化法治疗对兔眼结膜IL-1β表达的影响IL-1β阳性表达部位呈黄色或棕黄色染色, 主要表达于上皮细胞层, 胶原纤维中也有一些表达。靠近睑缘部上皮层细胞较多, 受炎症浸润, 可见有角化层。内侧睑结膜上皮细胞层可见大量杯状细胞, 在细胞间质可见IL-1β的表达, 阳性对照组与清热明目组在上皮细胞层表达较少, 见图 2。
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| 图 2 睑结膜表面IL-1β的表达(HE, 40×) Fig. 2 Expression of IL-1beta in conjunctiva (HE, 40×) A:正常组; B:模型组; C:阳性对照组; D:清热明目组 |
IL-6阳性表达部位呈黄色或棕黄色染色, 主要表达于上皮细胞层, 胶原纤维中也有一些表达。总体IL-6着色部位表达不太明显。外侧睑结膜上皮细胞层及睑板腺周围有少量表达。球结膜上皮细胞层下有表达, 阳性对照组及清热明目组的表达与正常组比差别不大, 见图 3。
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| 图 3 球结膜表面IL-6的表达(HE, 40×) Fig. 3 Expression of IL-6 in conjunctiva (HE, 40×) A:正常组; B:模型组; C:阳性对照组; D:清热明目组 |
TNF-α阳性表达部位呈黄色或棕黄色染色, 主要表达于上皮细胞层, 胶原纤维中也有一些表达。模型组上皮层表达最明显, 阳性对照组、清热明目组与正常组比差异不大, 见图 4。
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| 图 4 球结膜表面TNF-α的表达(HE, 40×) Fig. 4 Expression of TNF-alpha in conjunctiva (HE, 40×) A:正常组; B:模型组; C:阳性对照组; D:清热明目组 |
本实验中对病理组织学观察进行定性和半定量分析, 结果显示清热明目组、阳性对照组与模型组比较有统计学差异, 确定清热明目方的疗效, 在改善症状方面疗效明显。从病理图片上看, 利用超声雾化法清热明目方的治疗在炎症细胞减少的同时减轻了对结膜上皮细胞的刺激, 维持了结膜杯状细胞的功能, 保护眼表结构的完整性。
结膜炎是眼科的常见病, 大部分结膜与外界直接接触, 因此容易受到周围环境中非感染性因素(外伤、化学物质及物理因素等)和感染性因素(如病毒、细菌、及衣原体等)的刺激, 而结膜的血管和淋巴组织非常丰富, 自身及外界的抗原极易使其致敏而发生炎症反应[5]。由此出发, 以中医药理论为基础, 遣方用药, 选用清热利湿、疏风散邪, 清热解毒类中药, 以疏风清热止痒, 解毒明目退翳为法组成清热明目方。由于外障眼病多见风热上攻的表现, 用清热明目方对结膜炎模型的治疗体现了中医“异病同治”的思想。
结膜由鳞状上皮和杯状细胞组成, 有上皮层和固有层。上皮2~5层, 各部位的厚度和细胞形态不尽相同。固有层含有血管和淋巴管, 分腺样层和纤维层。腺样层较薄, 由纤细的结缔组织网构成, 其间有多量的淋巴细胞, 炎症时易形成滤泡。纤维层由胶原纤维和弹力纤维交织而成[6]。结膜中的杯状细胞是单细胞黏液腺, 多分布于睑结膜和穹窿结膜的上皮细胞层内, 分泌黏液, 维持眼表泪膜稳定。结膜炎症时结膜副泪腺和杯状细胞等功能会有不同程度受损, 随着结膜炎症减退, 杯状细胞的再生和功能恢复, 眼表微环境逐渐趋于恢复稳定, 临床眼表病变症状消失[7]。
本研究中清热明目方为纯中药制剂, 不含防腐剂, 避免了对结膜杯状细胞的损伤; 药物通过超声雾化直接作用于结膜病变部位, 减轻了对结膜上皮细胞的刺激, 可保护眼表结构。研究所采用的超声雾化法是借助超声雾化器治疗外眼疾病的新方法, 增加了药物的局部渗透性, 而不损伤泪膜, 具有良好的应用价值。
4.2 细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α与结膜炎相关性对兔眼结膜炎模型的相关炎性因子IL-1、IL-6和TNF-α进行免疫组织化学定位, 并进行定性分析, 表明结膜炎与其有一定的相关性。结膜上皮炎性因子的表达可以反映疾病的严重程度, 结膜炎症越重, 结膜上皮相应因子表达越明显。
外周IL-l是由活化的单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、肾上腺嗜铬细胞以等细胞合成的, 其中以单核/巨噬细胞合成大量的IL-l (主要是IL-1β)为主, 存在于血浆与组织液中[8]。大量文献报道IL-1作为炎前细胞因子, 与眼部许多疾病的发生、发展有关[9]。
IL-6常作为内源性致热源参与炎症反应, 能刺激T和B淋巴细胞活化增殖, 还可剌激诱导急性期反应蛋白合成, 促进炎症急性期反应[10]。
结膜组织中IL-6和TNF-α可促进纤维母细胞的繁殖和血管的形成作用[11], 同时还发现IL-6和TNF-α的表达同时增高; 但在通常状态下, TNF-α是IL-6的强诱导剂, IL-6则对TNF-α起着抑制作用[12-13]。
有学者对急性结膜炎患者血液中的TNF-α进行测定, 并研究其与IL-6的关系。急性结膜炎患者在治疗前血清TNF-α、IL-6水平均非常显著地高于正常人组。经抗炎等治疗后2周则与正常人比较无显著性差异且TNF-α与IL-6呈明显的正相关[14]。
诸多研究中, 对炎性因子与结膜炎本身的研究关系甚少, 本实验借鉴以上学者的研究经验, 结合课题目的进行设计研究, 结果表明, 结膜炎与炎性细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α有密切的关系, 但以上3种炎性因子在结膜上皮细胞层并非均为特异性表达。因细胞因子的特性, 在细胞内分泌, 可通过自分泌或旁分泌途径作用到靶细胞[15]。所以在结膜上皮细胞胞浆及细胞间质均可见染色, 在结膜固有层的胶原纤维中也有部分轻度表达。本实验因切片数量有限, 并未对免疫组织化学的结果进行定量的分析, 故可能对结膜炎与相关的炎性因子的关系并不能提供强有力的证据, 若要对结膜炎与炎性因子的关系进行更好的解释, 尚需进一步的研究。
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