舒血宁注射液为银杏叶提取物经加工制成的灭菌水溶液^[1-2], 主要包括黄酮类(24%)、萜内酯类(6%)化合物和微量元素等^[3-5]。舒血宁注射液具有使动脉扩张, 增加血流量, 促进血液循环, 调节胆固醇, 改善脑功能障碍、高血压、老年痴呆、记忆力减退等功效^[6~8], 主要用于治疗缺血性心脑血管疾病如冠心病、心绞痛、脑栓塞、脑血管痉挛等^[9]。近年来, 由于中药成分复杂, 关于中药注射液不良反应报道增多, 安全性问题日益突出^[10-12], 为了更好地控制舒血宁注射液的产品质量, 提高其安全性, 对舒血宁注射液中黄酮类和内酯类成分进行含量测定是十分必要的。

目前主要采用高效液相色谱-蒸发光散射检测散射检测器(HPLC-ELSD)法测定银杏制剂中萜内酯类化合物和高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)法测定黄酮类化合物含量^[13-19]。由于部分黄酮类化合物标准品价格较高或市场不可获得而限制多种黄酮类成分定量分析方法的应用。以槲皮素、山奈酚和异鼠李素为指标, 通过按照美国药典规定的转换因子, 可实现银杏叶制剂中总黄酮含量的测定, 是中药银杏制剂一种较好的质量评价方法。但由于银杏叶提取物中本身含有槲皮素、山奈酚、异鼠李素3种苷元, 直接测定水解后3种该化合物含量按照传统算法会导致总黄酮醇苷含量测量偏高; 同时, 一些银杏制品中如果人为掺有上述3种苷元或色谱峰相似的其他成分, 也会导致测量结果偏高^[20]。因此, 本研究拟以常见3种黄酮苷槲皮素、山奈酚、异鼠李素为指标, 水解舒血宁注射液黄酮醇苷成分, 通过水解前后3种黄酮含量差异, 建立舒血宁注射液总黄酮醇苷含量测定适宜的方法, 为舒血宁注射液的质量控制提供手段。

1 材料与试药 1.1 仪器

Aglient1260高效液相色谱系统(Extend-C₁₈色谱柱, UV检测器); 高速离心机(美国Sigma公司, 3K15);超纯水器(美国Millipore公司, Mill-QⅡ型); 涡旋混合器(上海沪西分析仪器厂, XW-80A); 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司, KQ-250E); 十万分之一天平(瑞士Mettler Toledo公司, AX205);电热恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂, HHS型)。

1.2 试剂与药品

槲皮素、山奈酚、异鼠李素标准品纯度均大于98%, 购自于成都德思特生物科技有限公司; 实验用水为Milli-Q超纯水(美国Millipore公司, Mill-QⅡ型); 甲酸为色谱纯(Tedia); 甲醇、乙醇、乙腈为色谱纯(天津市康科德科技有限公司); 其余试剂均为分析纯; 30批舒血宁注射液为河北神威药业股份有限公司提供。

1.3 色谱条件

色谱柱为Extend-C₁₈柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm); 流动相:0.1%甲酸水(A)和乙腈(B); 梯度洗脱; 梯度程序:0~10 min, 10%￫25%B; 10~25 min, 25%￫28%B; 25~34 min, 28%￫40%B; 34~35 min, 40%B￫10%B; 流速为1 mL/min; 进样体积为15 μL; 柱温为35 ℃, 紫外检测波长为360 nm。

1.4

对照品溶液精密称取槲皮素、山奈酚和异鼠李素对照品5 mg, 加甲醇配成浓度分别为1 mg/mL的单一对照品母液, 再加甲醇分别稀释成不同浓度储备液, 置4 ℃冰箱中保存备用。

1.5

供试品溶液取舒血宁注射液, 精密量取4 mL, 置于100 mL圆底烧瓶中, 加入37%盐酸-水-乙醇(4:10:25) 78 mL, 90 ℃加热回流水解2.5 h, 冷却至室温, 转移至100 mL容量瓶中, 加水至刻度线, 摇匀。将水解后溶液以14 000 r/min的速度离心10 min, 取上清液, 进样分析。

2 方法与结果 2.1 方法学验证 2.1.1 线性关系、线性范围、检测限(LOD)和定量限(LOQ)

将上述槲皮素、山奈酚、异鼠李素配制成母液分别为250、250、100 μg/mL的混合溶液, 将母液以2.5倍逐级稀释成8个点, 按照上述确定的色谱条件进样15 μL, 记录峰面积。以进样浓度X (μg/mL)为横坐标、峰面积Y为纵坐标, 绘制标准曲线。将混合对照品逐级稀释, 分别以信噪比S/N=3和S/N=10时各对照品的浓度作为LOD和LOQ。线性关系结果如表 1所示。

2.1.2 精密度实验

精密取同一批水解后舒血宁注射液样品, 按上述色谱条件进样15 μL, 连续进样6次, 记录色谱峰的峰面积, 相对标准偏差(RSD)值在0.29%~0.70%, 均小于5%, 符合精密度实验要求, 说明该方法精密度良好。

2.1.3 重复性实验

精密取同一批舒血宁注射液样品6份, 按上述方法制备供试品溶液, 按色谱条件进样15 μL, 连续进样6次, 记录色谱峰的峰面积, RSD值在0.18%~0.35%范围内, 均小于5%, 符合重复性实验要求, 说明该方法重复性良好。

2.1.4 稳定性实验

取同一批供试品溶液, 分别在0、2、4、8、12、24 h按照色谱条件进行色谱分析。记录峰面积, 计算RSD值, 在0.28%~0.49%, 结果符合稳定性实验要求, 说明该方法稳定性良好。

2.1.5 加样回收率

精密量取适量的槲皮素、山奈酚、异鼠李素对照品溶液, 配制成浓度分别为3、3、2 μg/mL的混合对照品溶液, 取0.5 mL混合对照品溶液加入已知含量的0.5 mL水解舒血宁注射液中, 配制供试品溶液。结果显示槲皮素、山奈酚、异鼠李素的回收率在98.8%~100%范围内, RSD值在0.070%~0.039%范围内, 表明该方法回收率良好。结果见表 2。

2.2 样品测定

取30批注射液, 按照上述方法制备供试品溶液, 按色谱条件进行测定, 记录色谱峰面积。将样品中3个待测成分的色谱峰面积代入相对应的回归方程中, 分别计算舒血宁注射液水解前后黄酮苷元的含量, 每批样品测定3份。按美国药典槲皮素、山奈酚和异鼠李素的转换因子分别为:2.504、2.580和2.437。按下面公式:总黄酮醇苷的含量=槲皮素含量×2.504+山奈酚含量×2.580+异鼠李素含量×2.437计算总黄酮苷含量, 其中槲皮素、山奈酚及异鼠李素含量均为水解后含量减去水解前含量。色谱图如图 1所示, 样品测定结果如表 3所示。

3 讨论

本研究在对舒血宁注射液进行水解时, 通过含量测定考察了不同水解时间的水解效果, 最终确定最佳水解时间为2.5 h。在对舒血宁注射液水解后样品进行含量测定的过程中, 供试品溶液需现用现配, 需在12 h内测定完全, 避免槲皮素不稳定而测定结果不准确。笔者在先前研究的基础上, 对总黄酮醇苷含量的计算方法稍作改进, 即通过查阅美国药典, 以槲皮素、山奈酚和异鼠李素为指标, 通过相对的转换因子, 分别计算舒血宁注射液水解前后的总黄酮醇苷含量, 避免了由于自身含有3种苷元而造成测量结果偏高, 使结果更加准确可靠。

本研究利用所建的HPLC法测定了30批舒血宁注射液中总黄酮醇苷含量, 发现30批舒血宁注射液总黄酮醇苷含量在0.97~1.17 mg/mL范围内。由实验结果可知, 该方法色谱分离较好, 线性关系良好, 且精密度、稳定性、重复率及回收率RSD值均小于5%, 说明该方法准确可靠, 可用于舒血宁注射液总黄酮苷的含量测定, 为其提供了有力的技术支撑。

4 结论

本研究分别以槲皮素、山奈酚和异鼠李素为指标, 通过对应的转换因子, 建立了同时测定样品水解后的总黄酮苷含量HPLC法。该方法操作简便, 准确快速, 可用于舒血宁注射液中总黄酮苷类化合物的质量控制。