癌性发热，又称为“癌热”、“肿瘤热”，是指肿瘤患者在排除感染、抗生素治疗无效的情况下出现的直接与肿瘤有关的非感染性发热，以及患者在肿瘤发展过程中因治疗而引起的发热^[1]。癌性发热是中晚期肿瘤患者的常见症状之一，有报道约2/3恶性肿瘤患者病程中伴有发热，而其中癌性发热占40%^[2]，严重影响患者的生活质量和生存期，其机制尚不十分清楚，目前尚缺乏有效的治疗手段，寻找持久、稳定、安全的解决癌性发热的方法成为目前研究的热点。癌热宁栓剂是根据中医理论，经科学研制而成的中药复方制剂。具有清热解毒、祛瘀凉血的功效。临床主要用于癌性发热或非感染性发热。为进一步研究该药物的解热作用及机制，通过以下体内实验研究可进一步为临床用药提供更有力的证据支持。

1 实验材料 1.1 实验动物

长耳大白兔24只，雌雄各半，体质量(2.5±0.5) kg，由天津中医药大学实验动物中心提供。

1.2 实验主要药品及试剂

癌热宁栓剂，由银柴胡、地骨皮、虎杖、青蒿、白花蛇舌草、土贝母等药物组成，栓剂由天津中医药大学中医药研究院制备，3 g/粒。中药浸膏，水煮醇沉法，用于动物直肠给药，每毫升含生药1.5 g。消炎痛栓，每粒100 mg，批号：H11021391，北京双吉制药有限公司。2，4-二硝基酚，每瓶25 g，批号：1601192，由上海市景颜化工科技有限公司提供。兔抗人NF-κB p65多克隆抗体、生物素化第二抗、山羊血清、苏木素染色液、SABC试剂盒、HRP-DAB底物显色试剂盒、白介素-6(IL-6) 酶联免疫反应(ELISA)分析试剂盒、前列腺素E₂(PGE₂)ELISA分析试剂盒、环氧化酶(COX-2) ELISA分析试剂盒、精氨酸加压素(AVP)ELISA分析试剂盒、α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)ELISA分析试剂盒：由天津优瑞尔生物技术有限公司提供。无水乙醇、4%多聚甲醛、二甲苯、70%乙醇、生理盐水、80%乙醇、蒸馏水、95%乙醇、3%双氧水、100%乙醇、磷酸盐缓冲液(PBS)，由天津易生源生物技术有限公司提供。

1.3 实验设备

电子秤，手术剪，眼科剪，石蜡切片机，石蜡包埋机，光学显微镜，分析天平，烘片机，恒温烤箱，高压锅，电磁炉，微量加样枪，湿盒，载玻片，盖玻片：天津中医药大学实验室提供。MGA-Ⅲ219型电子测温仪：北京师范大学司南仪器厂。3550型酶联免疫检测仪：美国BIO-RAD产品。SG-800型低速台式离心机：上海摩速科学器材有限公司。石蜡切片机：德国莱卡RM2015。深冻冰箱(-70 ℃)：日本三洋MDF-382E型。恒温水浴箱(HH-W420型)：江苏太仓医用仪器厂。倒置相差显微镜(LH50A型)：日本Olympus。多功能真彩色细胞图象分析管理系统：美国Media Cybernetics公司。

2 实验方法 2.1 实验前家兔处理

实验室温度保持在(21±1) ℃，湿度保持在(50±5)%。以紫外线灯照射消毒。实验前3天每日分早、中、晚测家兔体温3次，使其适应体温测量的刺激，测体温时以MGA-Ⅲ219型电子测温仪探头插入家兔肛门内4~5 cm处，记录直肠温度，取得平均值作为基础体温。家兔于实验前14 h禁食备用，可自由饮水。

2.2 药物制备与致热量的确定

根据前期实验研究，经预实验后将2，4-二硝基酚致热量确定为30 mg/kg，电子秤准确称量2 g 2，4-二硝基酚，加入无水乙醇100 mL，配置成浓度为20 mg/mL的亮黄色透明2，4-二硝基酚乙醇溶液，2~5 ℃保存，待用。

2.3 造模与分组

利用2，4-二硝基酚刺激家兔出现无菌性炎症，模拟临床癌性发热模型^[3]。实验第1~3天测得24只家兔基础肛温在38~39.6 ℃，体温波动在0.5 ℃以内，且每只家兔生长状况良好，符合实验要求，全部纳入实验。第4天开展实验，随机取6只设为空白对照组，背部皮下注射生理盐水1.5 mL/kg，剩余18只家兔用2，4-二硝基酚乙醇溶液背部皮下注射1.5 mL/kg进行造模，造模后筛选出2 h内体温升高超过1 ℃的家兔17只，按照随机数字表法随机分为模型组5只，癌热宁栓组6只，消炎痛栓组6只。

2.4 给药方法

造模后3 h给药，癌热宁栓组直肠给药癌热宁栓1粒/只，消炎痛栓组直肠给药消炎痛栓1粒/只。

2.5 观察指标 2.5.1 家兔一般生活状态

实验过程中观察不同组别家兔的精神状态、皮毛色泽、活动等有无变化。

2.5.2 对体温的影响

观察造模后0.5、1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0 h各组动物直肠温度变化。

2.5.3 对外周血IL-6、COX-2、PGE₂、AVP、α-MSH含量的影响

各组家兔于造模前、造模后3 h及给药后3 h从耳缘静脉采血约2 mL，用高速离心机将采取的血液离心10 min，取上清液血清，-70 ℃保存待测。检测采用酶联免疫吸附法，按试剂盒说明书操作，分别检测血清中IL-6、COX-2、PGE₂、AVP、α-MSH的含量。

2.5.4 对肝脏NF-κB表达的影响 2.5.4.1 免疫组化方法具体步骤

家兔处死后，快速剪切肝脏中叶靠近中间部分的1/3，大小约1×1×0.3 cm(厚度不超过0.5 cm)。对标本进行固定和包埋、切片、脱蜡、水化、抗原热修复、加入一抗、二抗、DAB显色和复染，最后在显微镜下观察切片，并进行×100和×400显微照相。

2.5.4.2 结果判定

NF-κB阳性表达为细胞核深染、细胞质出现棕色或棕黄色颗粒，细胞核未见染色、细胞质内无或少量棕色或棕黄色颗粒为阳性染色。根据阳性细胞率和阳性细胞着色强度分别记分。

评分标准：A为阳性细胞数所占比分级0~1%=0、1~10%=1、11~50%=2、51~75%=3、76~100%=4，0分为阴性，1分为阳性细胞数≦10%，2分为11%~50%，3分为51%~75%，4分为>75%。B为阳性细胞显色强度分级0(阴性，无色)、1(弱阳性，淡黄色)、2(阳性，棕黄色)、3(强阳性，棕色，棕褐色)，IHS=A×B>4为有统计学意义。使用SPSS 19.0统计软件数据包处理，本实验数据类型为单因素多组，各组间实验数据用均数±标准差(x±s)表示，组间的均数比较用方差分析，实验数据标准取α=0.05，若P < 0.05，则代表组间差异显著。

3 统计学方法

使用SPSS 18.0统计软件数据包处理，各组实验数据用均数±标准差(x±s)表示，单因素设计资料组间比较采用单因素方差分析，重复测量资料的组间比较用重复测量方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

4 结果与分析 4.1 家兔一般生活状态

空白对照组家兔活动正常，无发热、耸毛、抖动等表现。模型对照组、癌热宁栓组、消炎痛栓组家兔在注射2，4-二硝基酚30 min后体温开始上升，并出现耸毛、抖动、蜷缩等症状；约至3 h后，随着体温的明显升高，家兔耸毛、抖动、蜷缩等症状逐渐消失，但呼吸变明显急促，伴心跳加快。触其皮毛亦可扪及灼热，由于全身发热，家兔还表现出耳廓发红发热，部分扩张的血管周围可见出血点，眼结膜充血，个别家兔有稀便情况，但神志清醒。用癌热宁栓剂、消炎痛栓剂治疗约1 h后其症状与体征开始逐渐减轻。

4.2 体温经时变化值

如表 1所示，皮下注射2，4-二硝基酚后，模型家兔体温开始升高，0.5 h即出现发热，1 h后与空白对照组比较，模型动物体温明显升高，约3 h体温达峰值，发热呈单峰热。给药0.5 h后，癌热宁栓组与消炎痛栓组家兔体温较模型对照组体温开始下降(P < 0.05)，给药1 h后，癌热宁栓组与消炎痛栓组家兔体温较模型对照组体温明显降低(P < 0.01)，与空白对照组比较无统计学差异(P>0.05)。说明癌热宁栓与消炎痛栓具有退热作用，能完全对抗2，4-二硝基酚引起的发热效应。

4.3 对外周血IL-6、COX-2、PGE₂、AVP、α-MSH含量的影响 4.3.1 对外周血IL-6含量的影响

如表 2所示，造模后3 h各组造模家兔血清IL-6含量明显升高(P < 0.05)。给药后3 h，模型对照组家兔血清IL-6含量进一步升高，癌热宁栓组较模型对照组家兔血清IL-6含量显著下降(P < 0.05)，说明癌热宁栓对模型家兔血清IL-6升高效应具有抑制作用。

4.3.2 对外周血COX-2含量的影响

如表 3所示，造模后3 h各组造模家兔血清COX-2含量明显升高(P < 0.05)。给药后3 h，癌热宁栓组与消炎痛栓组较模型对照组家兔血清COX-2含量显著下降(P < 0.01)，说明癌热宁栓与消炎痛栓对模型家兔血清COX-2升高效应具有抑制作用。

4.3.3 对外周血PGE₂含量的影响

如表 4所示，造模后3 h各组造模家兔血清PGE₂含量明显升高(P < 0.05)。给药后3 h，癌热宁栓组与消炎痛栓组较模型对照组家兔血清PGE₂含量显著下降(P < 0.01)，癌热宁栓组与消炎痛检组无统计学意义(P>0.05)，表明癌热宁栓与消炎痛栓对模型家兔血清PGE₂升高效应具有抑制作用。

4.3.4 对外周血AVP含量的影响

如表 5所示，给药后3 h，癌热宁栓组与消炎痛栓组较模型对照组家兔血清AVP含量显著上升(P < 0.01)，癌热宁栓组与消炎痛栓组无统计学意义(P>0.05)，说明癌热宁栓与消炎痛栓均能促进解热因子AVP的含量上升。

4.3.5 对外周血α-MSH含量的影响

如表 6所示，给药后3 h，癌热宁栓组家兔血清α-MSH含量稍增，差异无统计意义(P>0.05)，而消炎痛栓组较组内造模后3 h血清α-MSH含量显著上升(P < 0.01)，较模型对照组亦明显升高(P < 0.01)，说明消炎痛栓能促进解热因子α-MSH含量上升，发挥退热作用。

4.4 对肝脏NF-κB表达的影响

如图 1及表 7所示，空白对照组(图 1A)家兔肝脏NF-κB的表达呈弱阳性，阳性细胞数较少。模型对照组(图 1B)较空白对照组NF-κB的表达呈胞核强阳性(3分)、胞质阳性(2分)，差异有统计学意义(P < 0.05)。癌热宁栓组(图 1C)和消炎痛栓组(图 1D)NF-κB的表达明显低于造模对照组(P < 0.05)。提示癌热宁栓与消炎痛栓对2，4-二硝基酚引起的家兔肝脏NF-κB的表达增多有明显抑制作用。

5 讨论

尽管目前癌性发热的机制尚不十分清楚，但多数学者认为可能与肿瘤细胞本身产生内源性致热源有关。NF-κB是一种分布广泛的转录因子，普遍存在于真核细胞中，许多基因的启动子中都有功能性NF-κB的结合位点，在细胞因子诱导的基因表达中起关键性的调控作用^[4]。研究显示^[5-6]，NF-κB调控的炎性途径有助于调节大脑控制的病症如发热，包括感染与非感染性发热。NF-κB调控的靶基因包括细胞因子(TNF-ɑ、IL-1β、IL-6等)、黏附分子(ICAM-1、VCAM-1等)、酶[COX-2、PLA2、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等]、化学趋化因子(IL-8)、免疫受体、生长因子[粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)]、急性期蛋白(C反应蛋白)等^[7-9]。本实验结果发现，家兔造模后体温升高的同时，伴有血清IL-6、COX-2、PGE₂的明显升高，及AVP、α-MSH含量的轻度升高。经癌热宁栓给药后，约0.5 h家兔体温下降即有统计学意义，随着时间推移，家兔体温也随之下降达正常水平，疗效与消炎痛栓相当，进一步肯定了癌热宁栓的退热效果。癌热宁栓发挥退热疗效的同时，发热家兔血清中IL-6、COX-2、PGE₂的含量也明显下降。结合本实验结果推导，癌热宁栓退热效果快，可能与抑制COX-2的活性从而抑制PGE₂的合成有关。并且癌热宁栓还能明显抑制IL-6的升高效应，而优于消炎痛栓，与该方中药如地骨皮、虎杖、白花蛇舌草等现代药理学研究结果相一致。此外，癌热宁栓还能明显提高发热家兔血清解热因子AVP的含量，对解热因子α-MSH的含量也有一定的促进作用，体现了中医药多靶点作用的特色。因此推导，癌热宁栓发挥疗效的机制可能与调控NF-κB通路有关。

癌性发热多出现在恶性肿瘤中晚期，由于放疗、化疗等积极的抗肿瘤治疗后，多数患者会出现不同程度的食欲不振，口服给药困难，对于这类患者，中药直肠给药方式简便廉验，栓剂给药有以下优点^[10]：可避免与胃、肠等消化道相互作用而使药物失活或药物刺激胃肠；中药经直肠吸收后，可避免受到肝脏的“首过效应”；中药大多苦涩，直肠给药更能耐受，同时也解决了中晚期肿瘤患者口服给药的困难。本实验充分利用栓剂作用优势，尝试改良汤型为栓剂，亦体现中医药外治特色。

癌热宁方疗效确切，作用迅速、持久、稳定，且无明显毒副作用，既能治疗发热之标，且能针对癌瘤之本而治，对控制患者病情，延缓进展，提高生存质量方面具有很大的优势。同时剂型的改良拓宽了给药的途径，亦是发挥了中医药外治法的特色。