子宫内膜异位症（EMS），简称内异症，是指子宫内膜在子宫腔以外的部位出现、生长、浸润、周期性出血，引发疼痛、不孕及结节包块等。其在育龄妇女中发病率高达10%，其中50%合并不孕^[1]，严重影响女性的身体健康和生活质量。EMS的病因病机尚未完全阐明。目前，Sampson的“经血逆流学说”是EMS发病学说的主导理论, 事实上，80%的女性存在着经血逆流现象，而只有10%发生EMS，由此可见，经血逆流学说并不能完全解释EMS发病机制。国内学者郎景和教授提出的“在位内膜决定论”，对经血逆流学说进行了很好的补充说明。1948年Markee通过观察恒河猴月经发生前，子宫内膜螺旋动脉出现痉挛收缩，推测月经期子宫内膜处于缺血、缺氧状态^[2]。1976年Maas通过猕猴实验发现输卵管除了在排卵期，其余时间接近无氧状态^[3]。由此可见，子宫内膜在发生异位时，必定经过局部缺血缺氧的变化。

1 实验材料 1.1 主要仪器

CO₂恒温培养箱（德国，Thermo公司），低温高速离心机（美国，Beckman），三气培养箱（美国，Thermo公司），倒置荧光显微镜（日本，OLYNPUS公司），流式细胞仪（美国，BD公司），光学显微镜（日本，OLYNPUS公司）。

1.2 主要试剂

DMEM/F12（美国，Corning公司），鼠抗人角蛋白（Cytokeratin）抗体、波形蛋白（Vimentin）抗体（英国，Abcam公司），Annexin V/PI试剂盒（天津，三箭公司）。

2 实验方法 2.1 标本来源

选择天津中医药大学第二附属医院手术治疗的EMS患者6例，子宫肌瘤患者8例，入选患者均为25~45岁，月经周期规律，无其他免疫、内分泌或代谢性疾病，术前6个月内未应用过激素类或抗炎类药物。术中取在位内膜于4 ℃无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中保存，1 h内带回实验室进行处理。

2.2 间质细胞原代培养

1）用无菌PBS冲洗子宫内膜组织2~3次，去除血块及黏液。2）用眼科剪将组织剪碎至约1 mm3的微粒（肉眼成糊状）。3）加PBS将组织移入离心管，用PBS洗涤沉淀2次，弃PBS，加入1:1的0.1%的Ι型胶原酶和0.25%的胰蛋白酶，消化液的体积为组织的2~4倍。混匀后置于37 ℃温箱中消化45~60 min，每10 min摇晃1次离心管。用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液终止消化。4）用100目的筛网滤除未消化组织，再将细胞悬液滤过400目筛网分离子宫内膜间质细胞和腺上皮细胞。5）将滤过的细胞悬液离心漂洗1 000 r/min离心5 min。6）弃上清液，用5 mL完全培养基DMEM/F12重悬细胞，反复吹打后种于培养瓶中，于37 ℃，5%CO₂条件下培养。24 h后间质细胞贴壁。7）每2天换液1次，每天观察细胞生长情况。当细胞铺满瓶底80%~90%以后进行传代。

2.3 细胞的鉴定

原代细胞消化传代2次后，细胞形态规则，以105个/mL的密度种于96孔板，进行细胞免疫荧光染色鉴定，间质细胞应用Vimentin抗体进行免疫荧光染色鉴定，PBS代替一抗作为阴性对照。见图 1。

2.4 细胞培养及样本收集

取第3代间质细胞，消化后以2×10⁵/mL的密度种于12孔板，培养24 h。弃原培养基，PBS洗1遍，加DMEM/F12基培。根据间质细胞来源子宫肌瘤和EMS患者分为5组:常氧对照组、常氧EMS组、缺氧对照组、缺氧EMS组、中药+缺氧EMS组。每组设3个复孔。常氧处理:细胞置于5%CO₂的细胞培养箱培养。缺氧处理:将细胞培养板放入94%N₂+5%CO₂+1%O2的3气培养箱缺氧干预24 h后，收集各组细胞，使用冷的PBS洗细胞2次，再用1×Binding Buffer制成1×10⁶/mL的细胞悬液。固定的死细胞行PBS清洗1次。在1.5 mL的培养管中加入100 μL细胞悬液（约1×10⁵个细胞）。加入5 μL的Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光处放置15 min，再加入5 μL PI，轻轻混匀，室温避光处放置10 min。各试验管中分别加入1×Binding Buffer缓冲液400 μL，混匀后置于冰上，1 h内上流式细胞仪测定结果。

3 统计学处理

用SPSS 19.0统计软件进行处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett’s T3法，P＜0.05为差异有统计学意义。

4 结果

双变量流式细胞仪的散点图上，左上象限为坏死细胞DNA碎片（FITC-/PI+）；左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是坏死细胞或陈旧性凋亡细胞，为（FITC+/PI+），而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。5个实验组凋亡率分别为:常氧对照组（4.20±1.42）%、常氧EMS组（2.93±0.81）%、缺氧对照组（12.53±1.67）%、缺氧EMS组（8.13±0.06）%、中药+缺氧ENS组（10.67±2.51）%。本实验结果表明，在相同氧浓度下比较EMS组及对照组细胞凋亡情况，常氧EMS组凋亡率低于常氧对照组（P>0.05），缺氧EMS组凋亡率低于缺氧对照组（P＜0.05）；比较不同氧浓度对于培养细胞的影响，缺氧对照组凋亡率高于常氧对照组（P＜0.01），缺氧ENS组凋亡率高于常氧ENS组（P＜0.01）；中药+缺氧EMS组凋亡率高于缺氧EMS组（P>0.05），见表 1，图 2。

5 讨论

缺氧是把双刃剑，缺氧可以促进随经血逆流的子宫内膜细胞凋亡，亦可以导致机体细胞免疫反应下降，不能完全吞噬清除病灶细胞。经过缺氧选择，残存的内膜细胞可能黏附侵入输卵管、卵巢、盆腔、腹膜等处，种植生成异位病灶。缺氧可使缺氧诱导因子-1（HIF-1）大量聚集。HIF-1是由α和β 2个亚基组成的异源二聚体，其中HIF-1α能决定HIF-1的活性和氧分子调节^[4]。有研究^[5]报道，HIF-1α可以激活多种抗凋亡基因，包括血管内皮生长因子（VEGF）、B淋巴细胞癌-2基因（BCL-2）和Caspase 3等，抑制诱导细胞凋亡的信号，从而阻止细胞凋亡。其中VEGF是目前公认的、最强的促血管生成因子，在缺氧的条件下它与促红细胞生长素（EPO）之间存在正相关，共同促进血管生成^[6]。Wnt/β-catenin信号通路是调控细胞生长和增殖的关键途径，Jolly Mazumdar等人研究发现在胚胎干细胞中HIF-1α可以增强β-catenin的活性^[7]，β-catenin是关键的转录激活剂并传输细胞外信号以激活靶基因^[8]，在Wnt信号通路激活过程中起关键作用^[9]。

中医传统理论认为EMS属于“痛经”、“癥瘕”范畴，著名中医妇科专家韩冰教授提出“气、血、痰”是EMS的3个关键因素，其病机为瘀久夹痰，渐成癥瘕，因此治疗多以活血化瘀、温经通络、散结止痛为主。韩冰教授临床经验方妇科灌肠Ⅱ号（丹参、三棱、莪术各30 g，乳香、没药各20 g，水红花子50 g）治疗EMS取得较好的临床疗效，不仅能明显改善症状和体征，且不良反应小。本实验发现缺氧组细胞凋亡率明显高于常氧组，说明缺氧可以促进随经血逆流的子宫内膜细胞凋亡；而缺氧EMS组细胞的凋亡率明显低于缺氧对照组细胞，说明EMS组在位内膜与对照组内膜存在本质差别，EMS在位内膜在缺氧环境中具有较强的抗凋亡能力。妇科灌肠Ⅱ号干预后，在位内膜的凋亡率升高，但无统计学意义，这可能是妇科灌肠Ⅱ号使局部缺氧环境得到改善，既影响了HIF-1α的表达，又使异位的内膜细胞得到了生长的机会。通过本实验可以认识到缺氧在EMS发生发展中的关键作用，但妇科灌肠Ⅱ号是如何起到治疗作用的，还需进一步研究。