中药为多成分复杂体系，其所含化学成分种类、含量及理化性质存在着差异，而中药指纹图谱是一种综合、可量化的质量控制手段，能够确切地反映中药有效部位中化合物的化学信息。目前，高效液相色谱（HPLC）指纹图谱技术是公认的应用最广的方法^[1]。然而以某一特定波长（一维）或多波长（三维图谱:包括时间、波长、吸收强度等）获得的指纹图谱^[2-4]很难同步完整地表征其化学成分特征，而PDA MaxPlot模式是对高效液相色谱-二级管阵列检测器（HPLC-PDA）三维图谱的简化处理，能够有效增强微量成分群化合物的灵敏度，并将具有紫外吸收差异较大的不同色谱峰同时反映在一张色谱图上，实现从全信息角度整体控制中药质量的目的。

黄连（Coptis Rhizoma）是常用中药之一，其主要化学成分为异喹啉类生物碱，还含有木脂素类、黄酮类、有机酸类等非生物碱类成分^[5-7]，而其吸光度、溶解度等理化性质存在明显差异。本研究以黄连为研究对象，采用对照药材作为随行对照，采集表征全谱峰特性的PDA MaxPlot谱图，建立黄连HPLC紫外可见全谱峰指纹图谱分析方法，为更加准确地反映黄连中各类成分的特征和有效控制该药材质量提供科学依据。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Waters Alliance高效液相色谱仪（Waters 2695分离单元、Waters 2996 PDA检测器、Empower 2色谱工作站）；Sartorius ME235S十万分之一天平、Sartorius BSA-224S万分之一天平（德国，Satorius公司）；Milli-Q Academic超纯水机（德国，默克密理博公司）；AS3120A超声清洗器（天津，奥特赛恩斯仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品盐酸小檗碱（批号110713-201212，含量以86.7%计）、盐酸巴马汀（批号110732-201108，含量以86.2%计）、盐酸药根碱（批号110733-201108，含量以90.3%计），对照药材黄连（三角叶黄连，批号120913-200407）均由中国食品药品检定研究院提供；非洲防己碱（批号AB727C，含量以98%计）、黄连碱（批号AB691C，含量以98%计）、表小檗碱（批号AB726E，含量以98%计）对照品均购于天津一方科技有限公司。乙腈、三氟乙酸（≥99.5%）、甲醇等均为色谱纯；盐酸为优级纯；超纯水为Milli-Q自制。

黄连样品批号分别为:1303060、1312128、1401129、

1403169、1404018、1407018、1408058、1411024、1412038、1501202，由天津市中药饮片厂有限公司提供；S-1和S-2购于天津老百姓大药房。以上样品经天津市滨海新区中医医院刘海副主任中药师鉴定为毛茛科植物黄连Coptis Chinonsis Franch.的干燥根茎。

2 方法与结果 2.1 对照品溶液的制备

分别取盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、盐酸药根碱、非洲防己碱、黄连碱、表小檗碱对照品适量，精密称定，加80%甲醇配成浓度为2.0 μg/mL的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

供试品溶液的制备方法主要参考2015版《中国药典》一部黄连【含量测定】项下供试品溶液的制备方法，并作相应调整。具体方法如下:取黄连粉末（过二号筛）约0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1%盐酸甲醇溶液10 mL，密封，称定质量，超声处理30 min（功率200 W，频率40 kHz），放至室温，称质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过；精密量取续滤液1 mL，置25 mL量瓶中，加80%甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件

Agilent SB-C18色谱柱（4.6 mm× 150 mm，3.5 μm）；以乙腈（A）-0.1%三氟乙酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为0~15 min，8.0%~29.0%A；15~18 min，29.0%~30.0%A；18~23 min，30.0%~38.0% A；流速为1.0 mL/min；柱温33 ℃；进样量3 μL；检测波长为210 ~400 nm，提取MaxPlot和345 nm的色谱图。黄连MaxPlot和345 nm典型色谱图见图 1。

2.4 黄连指纹图谱的建立 2.4.1 精密度实验

取同一批黄连对照药材，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液1份，按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，并提取MaxPlot色谱图，以盐酸小檗碱峰（峰14）作为参照峰（S），计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD为0.017%~0.17%，相对峰面积的RSD为0.46%~2.03%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱技术要求。

2.4.2 重复性实验

取同一批黄连对照药材，按照“2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份。按“2.3”项下色谱条件测定，记录色谱图，并提取MaxPlot色谱图，以盐酸小檗碱峰（峰14）作为参照峰（S），计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD在0.015%~0.21%，相对峰面积的RSD在0.84%~2.83%，表明该方法重复性良好，符合指纹图谱技术要求。

2.4.3 稳定性实验

取同一批黄连对照药材，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液1份。按“2.3”项下色谱条件，分别在0、2、8、10、12、16、20、22、24 h进样测定，记录色谱图，并提取MaxPlot色谱图，以盐酸小檗碱峰（峰14）作为参照峰（S），计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD为0.018%~0.14%，相对峰面积的RSD为0.58%~2.65%，表明供试品溶液在24 h内稳定，符合指纹图谱技术要求。

2.4.4 特征指纹图谱的构建及共有特征峰的标定

采用已验证的方法测定12批黄连样品，记录其色图谱，比较各批次黄连样品的MaxPlot色谱图，结果见表 1。其中4批黄连样品含有13个色谱峰；2批黄连样品含有12个色谱峰；6批黄连样品含有11个色谱峰。同时，采用随行对照与相对保留时间共同标定共有指纹峰，共标定11个共有峰，其中峰10、12、13的单峰面积占总峰面积的10%以上，峰1~5、8~10的单峰面积占总峰面积小于10%，上述各峰在不同批次间峰面积差异RSD在1.1%~11.4%，稳定性良好，将其确定为共有峰；峰6、7、12为非共有峰，非共有峰总面积小于总峰面积的5%。在相同的色谱条件下，测定盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、盐酸药根碱、非洲防己碱、黄连碱和表小檗碱对照品溶液，并与样品指纹图谱中相应色谱峰进行比较，其中可确认色谱峰8所代表的化学成分为非洲防己碱，色谱峰9为表小檗碱，色谱峰10为药根碱，色谱峰11为黄连碱，色谱峰13为巴马汀，色谱峰14为小檗碱。

2.4.5 特征指纹图谱相似度评价

将系统适用性测试获得的6份MaxPlot色谱图（同“2.4.1”项下精密度实验）导入国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2.0版），以第6份黄连色谱图作为参照图谱，在“生成对照”模式下，剪切6 min前的溶剂峰，基于平均数对照谱图生成法，时间窗宽度0.1，多点校正以峰面积占总峰面积的0%以上的峰参加全谱峰匹配生成黄连对照特征指纹图谱，即黄连随行对照标准指纹图谱R，见图 2。在“分析检测”模式下，导入12批黄连饮片的色谱图，剪切6 min前的溶剂峰，以全谱峰匹配方式计算各批次黄连饮片指纹图谱与黄连随行对照标准指纹图谱R的相似度，其相似度计算结果显示，12批黄连饮片指纹图谱相似度在0.994~0.999之间，见表 1。

3 讨论

目前，以HPLC-PDA色谱图为基础建立多波长指纹图谱，存在多张谱图重复分析且难以对复杂多成分进行同时定性研究的缺陷。而PDA MaxPlot谱图是对HPLC-PDA三维图谱的简化处理，能够有效增强微量成分群化合物的灵敏度，并将具有紫外吸收差异较大的色谱峰同时反映在一张色谱图上，实现从全信息角度整体定性鉴定中药质量的目的。本研究利用二极管阵列检测器在210~400 nm范围内进行全波长扫描，并分析MaxPlot图谱和345 nm下的图谱，结果显示MaxPlot图谱色谱峰信息相对于单一波长丰富，且能最大程度上表征色谱峰信息（峰面积、峰高、光谱图等），并将紫外吸收差异较大的物质呈现在同一谱图中。因此，采用MaxPlot技术建立黄连药材指纹图谱是切实可行的。

本研究采用黄连对照药材作为随行对照结合Maxplot技术所建立的黄连指纹图谱，能够完整全面地体现黄连药材各成分的特征，增强了其整体专属性^[8]，提高了检测方法的重现性与准确性^[9]；较单一波长345 nm下多检测1个微量成分峰，共标定11个共有峰，确定了其中6种主要生物碱成分，同时体现出黄连中各生物碱的纯度、结构、光谱信息、保留时间等综合信息。12批黄连样品指纹图谱与对照药材随行对照标准指纹图谱相似度达0.994以上。本方法为黄连饮片的质量研究提供了更客观的评价指标与简便、科学的方法，可用于黄连的质量控制，以保证其临床疗效稳定。