自从美国高血压预防治疗指南（JNC7）提出“高血压前期”概念后^[1]，高血压前期逐渐为人们所关注，De Marco等^[2]研究发现高血压前期人群4 a后进展至高血压的比例为38%，孙佳艺等^[3]对国内35~64岁人群10 a的跟踪调查发现高血压前期进展至高血压的比例为52.6%。基于近年来中国流行病学、临床实践以及对高血压病的研究，以高盐为代表的环境因素已成为高血压前期[血压120~139/80~89 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa，下同）]的主要危险因素^[4]。因此，在高血压前期进行干预，从调控环境因素入手，将血压防治重心前移，有望成为延缓高血压病发生和发展的一种新手段。

目前，中医还没有关于高血压前期的辨证分型标准和有效的治疗方法，但有调查表明，大部分高血压前期患者已有神疲乏力、四肢困倦、腹胀体胖、少气懒言、头晕目眩、舌淡胖、苔白腻等气虚的症状^[5-6], 根据“盐者胜血”的中医理论^[7-9]，以及中医治未病的思想^[10-11]，笔者选用具有“补气活血，祛瘀通络”功效的补阳还五汤进行治疗。本实验采用公认的高盐所致高血压作为环境因素诱导的Dahl盐敏感大鼠复制高血压前期模型，研究大鼠血液中T淋巴细胞亚群CD4⁺和CD8⁺的比例与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、γ-干扰素（INF-γ）的含量。通过观察T淋巴细胞亚群CD4⁺与CD8⁺淋巴细胞比值、TNF-α、INF-γ的含量变化，探讨高血压前期与机体免疫功能相关性，并以期阐释补阳还五汤调节机体T细胞的免疫功能，改善血压高值状态的作用机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物

选用7周龄雄性盐敏感大鼠（DS）与盐抵抗大鼠（SS），各20只，共40只。许可证编号：SCXK（京）2012-0001，动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2 药物与试剂

补阳还五汤（黄芪30 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，当归6 g，地龙3 g，桃仁3 g，红花3 g），购于辽宁省中医院中药局；大鼠外周血淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）；CD3/CD8/CD4检测试剂盒（美国BD公司BD PharmingenTM）；大鼠INF -γ酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海艾莱萨生物科技有限公司）；大鼠TNF-α ELISA试剂盒（上海艾莱萨生物科技有限公司）。

1.3 仪器

FACSAria Ⅲ流式细胞仪（美国BD医疗器械有限公司）；智能无创血压计(BP-2010A日本)；多功能酶标仪（SpectraMax I3奥地利Molecular Devices公司）。

2 方法 2.1 动物分组与造模

选取7周龄DS大鼠与SS大鼠各20只，SS大鼠随机分为正常组和正常给药组，DS大鼠随机分为模型组和治疗组。各组大鼠在SPF级动物实验中心以室温18~23 ℃、相对湿度45%~55%、自由饮水、普通饲料（由辽宁本溪长生生物技术有限公司提供）进食的条件下适应性喂养1周后，改用8%氯化钠（NaCl）高盐饲料（由北京科奥协力饲料有限公司提供）喂养。在高盐喂食期间，每日采用大鼠智能无创血压计监测大鼠尾动脉收缩压，12 d后其血压值升高至120~139/80~89 mmHg时，确定为高血压前期大鼠模型。

2.2 干预方法

补阳还五汤：黄芪30 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，当归6 g，地龙3 g，桃仁3 g，红花3 g，以上为成人1日剂量，共52.5 g。按照每千克体质量大鼠的给药量为人的6.3倍换算，给药量为0.55 g。将补阳还五汤水提浓缩至0.55 g/mL后，装入药瓶中，置于4 ℃冰箱保存备用，用前加热至37 ℃。正常给药组和模型给药组大鼠每天灌胃1次，连续治疗5周。正常组和模型组灌服等量蒸馏水，方法同上。

2.3 标本取材

SS和DS大鼠治疗结束后，每组大鼠禁食不禁水12 h后，腹腔注射20%氨基甲酸乙酯溶液，剂量按照0.4 mL/100 g给药，待其完全麻醉后，固定于实验台上，用0.5%碘伏消毒大鼠腹部皮肤，沿腹中线迅速打开腹腔，取腹主动脉新鲜血液2 mL，抽入含有肝素钠的抗凝采血管中，上下反复颠倒8~10次，使血液与肝素钠充分混匀，6 h内采用流式技术上机处理。

2.4 检测方法 2.4.1 流式细胞术检测大鼠全血中CD4⁺与CD8⁺的百分率

1）血液中单细胞悬液的制备：取12支15 mL离心管，分别加入2 mL大鼠淋巴细胞分离液。将样本血液缓慢加在分离液的液面上，18~22 ℃，1 800 r/min离心15 min。离心后吸出上层分离液（包含淋巴细胞的细胞层），弃去剩余液体。缓慢吸取分离液层及淋巴细胞层置转移至新的5 mL离心管内。加入3 mL细胞洗涤液混匀。1 800 r/min离心15 min，弃上清，再加入3 mL细胞洗涤液重悬所得细胞，1 800 r/min离心15 min，弃上清，重复以上步骤后以0.05 mL磷酸液缓冲液（PBS）后续实验所需相应液体重悬所得细胞。2）样品制备：取12支流式上样管，制备好加完50 μL PBS的单细胞悬浮液并进行编号，分为4组，每组3管样品；依次加入单标记的CD4⁺、CD8⁺荧光抗体各20 μL，涡旋均匀。室温避光孵育20 min；每管分别加入2 mL PBS，混合均匀，300 g离心5 min，弃上清；每管再分别加入0.6 mL PBS涡旋混匀，4 ℃避光1 h内上机检测。3）流式细胞术检测T淋巴细胞中CD4⁺与CD8⁺的百分率：创建新实验的12个采集管命名；选中采集管，设置参数，仅保留与本实验相关的荧光参数，荧光参数选择对数，散射光参数选择线性，参数均选择A面积信号；调电压，切阈值，设门；调自动补偿；进行检测统计。

2.4.2 ELISA方法检测大鼠血清中TNF-α、INF-γ的含量

设置标准品孔和样本孔，配置不同浓度的标准品并向不同标准品孔中加入标准品50 μL，样品孔加入40 μL样品稀释液与10 μL样品即血清，空白孔不加；用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴30 min；弃去液体，用洗涤液反复洗涤3次；各孔加入酶标试剂50 μL，37 ℃避光30 min；再次洗涤3次；每孔加入A显色剂50 μL，B显色剂50 μL，37 ℃避光显色15 min；加入终止液50 μL，15 min内在450 nm波长测定各孔OD值；通过标准曲线方程计算样品浓度。

2.5 统计分析

采用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行分析，全部数据先进行正态性检验及方差齐性检验，再进行单因素方差分析。组间两两比较方差齐采用LSD法分析。结果以均数±标准差（x±s）表示，P＜0.05认为有统计学差异。

3 实验结果 3.1 各组大鼠全血中CD4⁺/CD8⁺的比值

与正常组相比，模型组大鼠血中CD4⁺/CD8⁺的比值下降，具有差异性（P < 0.05）；与模型组相比较，治疗组大鼠血中CD4⁺/CD8⁺的比值升高，具有统计学差异（P < 0.05）。见表 1、图 1。

3.2 各组大鼠血清中INF-γ、TNF-α含量

与正常组相比，模型组大鼠血清中INF-γ、TNF-α的含量升高，具有差异性（P < 0.05）；与模型组相比较，治疗组大鼠血清中INF-γ、TNF-α含量降低，具有统计学差异（P < 0.05）。见表 2。

4 讨论

高血压前期是介于正常血压与高血压之间的阶段，没有明显的可查症状，既是属于“病虽未成，已有征兆”的未病状态，又是血压从正常高值到高值的关键过渡期。《黄帝内经》中提出了“盐者胜血”的理论，即高盐饮食或过食食盐可以伤及血脉，导致血液运行不畅，容易引起血脉的瘀滞^[12]，加之多数高血压前期患者在这一状态下又出现了气虚的症状，气虚与血瘀并见，与补阳还五汤方证相合。另有研究表明，在这一时期机体免疫细胞数量发生改变，尤其是血液中白细胞（WBC）计数升高^[13]，而补阳还五汤可以减少自身免疫性脑脊髓炎脾脏的CD4⁺ IFN-γ⁺T细胞，增加CD4⁺CD25⁺、CD4⁺IL-10⁺ T细胞数量，抑制TNF-α、IFN-γ等炎性因子的释放，具有促进炎性Th1细胞转化为抗炎的Th2型及调节性T细胞, 抑制炎性反应, 降低T细胞趋化因子的表达的作用^[14]。

已经研究证实，免疫系统异常是引起血压升高的重要机制之一^[15-16]，T淋巴细胞作为主要的淋巴细胞，在机体细胞免疫的过程中发挥着重要作用。成熟的T细胞按CD表型不同分为CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞两大类^[17]。活化的CD4⁺T淋巴细胞的主要功能是产生细胞因子产生免疫应答或调节免疫应答。如CD4⁺T淋巴细胞亚群中的Th1细胞可分泌INF-γ、TNF-α等细胞因子。INF-γ可以促进Th1细胞分化以及内皮细胞黏附因子的表达，抑制Th2细胞分化^[18]。TNF-α通过促进血管平滑肌细胞迁移与增殖，改变血管通透性，同时介导多条与炎症有关的信号通路，发生炎症反应^[19]。活化的CD8⁺T淋巴细胞最突出的作用是特异性杀伤靶细胞，因此又被称为细胞毒性T细胞。机体生理状态下CD4⁺/ CD8⁺两者保持一定比例，会处于相对平衡稳定的状态。当他们比例失调时，会引起机体一系列的病理生理改变^[20]。

本实验研究结果表明，与正常组比较，模型组大鼠血液中CD4⁺T与CD8⁺T淋巴细胞百分比增加，CD4⁺/CD8⁺比值下降，说明高血压前期大鼠机体T淋巴细胞亚群比例失调，免疫功能紊乱。血清中INF-γ与TNF-α的含量上升，提示由于大鼠T淋巴细胞亚群比例的异常变化，引起Th1细胞分泌的INF-γ与TNF-α等炎症因子分泌增多，可能辅助CTL、NK细胞、巨噬细胞的活化和增殖，促进Th1细胞或相关内皮细胞表达黏附因子，亦或激活了由TNF-α介导的信号通路，加强了炎症反应程度。补阳还五汤干预后，治疗组大鼠CD4⁺T与CD8⁺T淋巴细胞百分比下降，CD4⁺/CD8⁺比值上升，INF-γ与TNF-α的含量下降，表明补阳还五汤可能是通过调节CD4⁺T与CD8⁺T淋巴细胞百分比CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞比例，改善机体免疫能力，抑制INF-γ与TNF-α炎性因子的分泌以及由他们导致的病理生理过程，延缓高血压前期的发展进程。