苏合香等开窍药的使用是中医治疗中风的特色，常用于中风急性期的治疗，临床屡有验效，尤其是在改善患者的意识障碍和提高药物的起效时间上具有独特优势。苏合香早期干预可减轻大鼠脑缺血急性期脑损伤^[1-2]。由于开窍药常用于中风急性期的治疗并遵循“只宜暂用，不可久服”的使用特点，历来研究仅关注苏合香对中风急性期的临床和药理作用及机制，尚无相关追踪研究苏合香对脑缺血后长期神经功能恢复的影响。本研究拟在前期工作的基础上，进一步探讨苏合香在脑缺血急性期体现的保护作用是否有益于长期持续的神经功能修复及其可能的作用机制。

1 材料 1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠，体质量250~ 280 g [SPF级，购自北京维通利华生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001]，饲养于普通环境动物房（笼中饲养，温度25 ℃，湿度65%，12 h白昼循环），自由进食、进水，术前12 h禁食禁水。

1.2 实验药物

精密称取苏合香油（原产地英国，经鉴定符合《中国药典》2010版一部标准），与吐温80充分研磨后，分次加入少量纯水研磨混匀，配置成0.04 g/mL浓度的苏合香溶液（含0.25%吐温80），于棕色广口瓶中常温保存，具体参照本课题组前期发表工作^[2]。

1.3 主要试剂

CD31抗体（ABCAM，AB64543，1:100）、Synatophysin抗体（ABCAM，AB8049，1:100）、CY3-山羊抗兔（Jackson，111-165-003，1:300）、CY3-山羊抗小鼠（Jackson，115-165-003，1:300）。

2 方法 2.1 模型制备

参照Longa、Kuga等的方法^[3-4]予以改进，采用颈外-颈内动脉插入线栓（北京西浓科技有限公司，A5，2636、2838）法，建立大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型，激光多普勒血流监测仪（LDF）监测大脑中动脉支配皮层局部血流下降为血流基值的25%以下视为造模成功。阻塞2 h后缓慢将线栓抽出，并将ECA断端结扎，松开CCA动脉夹，缝合皮肤。假手术组仅离断右侧ECA，不予栓塞。小动物加热板维持大鼠术中肛温37 ℃，术后30 ℃保温，并予5 mL生理盐水腹腔注射以防止脱水，大鼠苏醒后放回笼中。

2.2 药物与分组

大鼠适应性饲养1周后随机分为对照组和苏合香组，由单独人员记录编号与分组并给药。所有大鼠均按10 mL/kg灌胃给药，即单次给药剂量为0.4 g/kg，分别于术后1、3、6 h各给药1次。对照组给予0.25%吐温溶液。

2.3 体质量监测及神经行为学评分

于术前及大鼠脑缺血术后1、4、7、14、21、28 d时分别称量大鼠体质量。参照文献标准及方法，对大鼠进行神经行为学功能测试：于脑缺血1、4、7、14、21、28 d时采用改进后的神经缺损评分（mNSS，18分制）综合考察大鼠运动（肌肉状态、异常运动）、感觉（视觉、触觉、本体觉）、反射功能^[5-7]。

大鼠脑缺血前进行训练后，于脑缺血1、4、7、14、21、28 d时采用足误实验评价大鼠感觉运动功能^[8-9]：大鼠被置于网格上行走，当肢体从网格上掉落或打滑，记作1次足误，共计数大鼠行走50步内患侧肢体足误次数；大鼠脑缺血前进行训练后，于脑缺血1、4、7、14、21、28 d时进行胶带去除实验以评价大鼠感觉运动神经缺损^[10-11]：将合适大小、黏度的医用胶布粘贴于大鼠患侧前爪掌侧，计数大鼠揭下胶布的时间。

2.4 死亡率评价及苏木精-伊红（HE）染色

于各观测时间点记录由缺血原因导致的死亡数，分别统计死亡率。于脑缺血28 d时取材：大鼠以10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉后，夹闭腹主动脉，迅速开胸暴露心脏，先以约200 mL冰磷酸盐缓冲溶液（PBS）心脏灌流，先快后慢，至流出液体澄清，再以约100 mL 4%多聚甲醛缓慢灌流，可见大鼠上肢剧烈抽搐。灌流完毕后立即冰上断头取脑，置于4%多聚甲醛中固定3 d后，经蔗糖、梯度乙醇脱水，石蜡包埋。于前囟-2.8 mm左右^[12]作连续冠状切片，厚度4 μm，并将切片黏贴于多聚赖氨酸包被的载玻片上，-20 ℃保存备用。通过HE染色的方法观察缺血后28 d脑组织修复情况。

2.5 免疫组织化学法

采用免疫荧光技术，检测缺血周边脑组织中CD31的表达以观察血管密度，检测缺血周边脑组织中SYP表达以观察突触密度，间接观察苏合香对大鼠脑缺血后28 d内源性神经血管重塑的影响。简要步骤如下：石蜡切片脱蜡至水后抗原修复、冷却洗涤。加一抗（阴性对照切片以pH7.4 PBS替代）、二抗，切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。切片于显微镜下观察并采集图像，选取不同位置的多个高倍镜视野，分别计数每个视野阳性表达量。

2.6 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，数据均以均数±标准差（x±s）表示。各时间点的比较采用Bonferroni校正后的重复测量的方差分析（ANOVA）。组间比较采用两独立样本间的t检验，计数资料采用χ²检验，均以P < 0.05为差异具有统计学意义。

3 结果 3.1 苏合香对大鼠脑缺血后体质量及神经行为学功能的影响

1）大鼠体质量在造模前均一，在脑缺血1、4 d时下降、缺血7~28 d时逐渐上升，相比于对照组，苏合香组体质量降幅较小而增幅较大，但两组间各时间点同比无显著差异，见表 1。2）大鼠mNSS评分在缺血1 d时较高，缺血7、14、21、28 d时逐渐降低，苏合香组各时间点mNSS评分均低于对照组，其中缺血21、28 d时的mNSS评分较对照组显著降低（P < 0.05），见表 2。3）健康大鼠经过足误实验、胶带去除实验训练后，缺血1 d时胶带去除时间及行走中患肢足误步数明显升高，后逐渐降低，同比于对照组，苏合香组各时点胶带去除时间及肢体足误步数均下降，并显著降低了脑缺血4、7、14 d时肢体足误步数（P < 0.05），见表 3、表 4。

3.2 苏合香对死亡率及脑组织修复的影响

本次实验共纳入受试动物共28只，缺血后28 d实际存活12只，其中对照组死亡率60%，苏合香组死亡率53.85%，两组间比较差异无显著性，见表 5。HE染色结果显示，脑缺血后28 d，大鼠脑组织梗死灶固化、卒中囊、胶质瘢痕形成，与非梗死区域形成明显界限，苏合香组脑组织修复程度优于对照组，尤其是对前囟-2.8 mm之后的脑组织，与课题组前期2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色结果显示苏合香对第4、5、6片脑冠状切片（厚2 mm）梗死面积改善更显著相一致，见图 1。

3.3 苏合香对缺血周边血管、突触密度的影响

与对照组比较，苏合香组缺血周边脑组织中CD31阳性表达的血管数量显著升高（P < 0.05），其中以皮层、纹状体较为明显，见表 6、图 2。缺血周边海马、纹状体中SYP阳性表达较明显，而在缺血周边皮层中阳性表达相对较少，与对照组比较，苏合香组缺血周边SYP表达量显著升高（P < 0.05），见表 7、图 3。

4 讨论

脑卒中治疗药物的研究始终存在着从实验室到临床的转化障碍，失败的教训给科学界带来重要启示，即应更加注重药物是否改善缺血后的病理转归，应全面着眼于内源性的神经保护机制和长期的神经功能恢复等终点结局指标，而不一味注重对分子生物学机制通路的影响，以增强实验室研究的临床转化性^[13]。基于上述理念，本研究在课题组前期工作的基础上，进一步观察苏合香在脑缺血急性期体现的保护作用是否有益于长期持续的神经功能修复。

实验选取脑缺血后1、3、6 h给药干预是基于如下理由：临床多将苏合香用于中风急性期的治疗；脑缺血后6 h内部分病理改变可逆，是治疗的黄金时期；药代动力学研究表明，苏合香灌胃给药后29 min即可达血药浓度高峰，其药物半衰期不超过1 h^[14]。基于以上因素并考虑大鼠胃容量，本研究统一于脑缺血后1、3、6 h分别给药1次，以期在最佳治疗时间窗给药并最大程度维持血药浓度，在此情况下观察单味苏合香能发挥的最大作用效应。结果显示，苏合香可降低各观测时点的各项神经行为学评分，进一步分析发现，两组间神经行为学评分在缺血后4、7、14 d时差距明显，而在缺血28 d时却趋于一致，说明苏合香可能促进或放大了内源性修复机制的启动，与其临床应用中可提高药物的起效时间或许互为对应。同时，苏合香对大鼠死亡率、体质量增长、脑组织修复情况也有良性改善作用；在机制研究方面，选取了神经血管重塑环节终末产物的替代性标记物CD31、SYP。其中CD31可标记新生血管，而血管新生是神经血管重塑的必要条件，新生血管的成熟度和微血管密度对恢复缺血区的血流灌注、促进卒中后的神经功能恢复至关重要。研究表明，血管密度高的卒中患者的预后明显好于血管密度低的患者^[15]。缺血性脑卒中后神经功能的障碍亦伴随着突触的损害或传递效能下降^[16-17]，SYP是分布于突触囊泡表面的含量最多的蛋白（约占10%），对突触的重塑及突触内神经递质的传递具有重要作用^[18]。实验结果表明，大鼠在脑缺血后28 d存在内源性的血管神经新生，其中突触重建在海马齿状回、纹状体较明显，血管新生在缺血周边皮质、纹状体脑组织较明显，在海马区则很少，这与其他文献报道的结果一致^[19-21]。

综上，本研究初步表明，苏合香早期干预可促进大鼠脑缺血后长期神经功能修复，可能是通过促进或放大内源性的神经血管重塑而实现。