长期大量饮酒可导致酒精性肝病。近年来，随着人们生活方式的转变，酗酒的人越来越多，从而使酒精性肝病（ALD）的发病率逐年激增。五田保肝液是经长时间临床验证有防治ALD确切疗效的复方中药，但其作用机制尚不明确。本研究通过探讨五田保肝液对ALD大鼠肝细胞凋亡，以及肝组织中Fas、Fasl、Caspase-8蛋白表达的影响，从而揭示五田保肝液防治ALD的可能机制。

1 材料与方法 1.1 动物

由中国医学科学院实验动物研究所提供的清洁级雄性Wistar雄性大鼠100只，体质量180~200 g左右。

1.2 实验用药和主要试剂

五田保肝液由天津市汉沽区中医医院惠赠；62度牛栏山二锅头（北京顺鑫农业股份有限公司生产）、阳性药易善复（北京安万特制药有限公司）、TUNEL试剂盒、兔抗Fas多克隆抗体、兔抗Fasl多克隆抗体、兔抗Caspase-8单克隆抗体，免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）均购自武汉博士德生物公司。

1.3 实验方法 1.3.1 模型制备

采用随机数字表方法将大鼠分为正常对照组10只，模型组、阳性药对照组、五田保肝液低、中、高剂量组各18只。给药方法如下：除正常组外的各组大鼠均以62度牛栏山二锅头酒（10 mL（/ kg·d）早晚灌胃。两次灌酒之间，中药低、中、高剂量组和阳性药组大鼠分别给予0.51、1.02（成人等剂量）、2.04 g（/ kg·d）的五田保肝液和成人等剂量的易善复灌胃。正常对照组每日3次以等剂量生理盐水灌胃。造模时间历时12周。

1.3.2 取材

末次灌胃后，禁食但不禁水12 h，之后采用乙醚麻醉后断头法处死大鼠，剖腹取肝组织，肝右叶以10%中性甲醛水溶液固定，拟进行形态学指标检测之用。

1.3.3 指标检测

固定后的肝组织石蜡包埋，切片后进行苏木精-伊红（HE）染色，判断是否造模成功。然后进行TUNEL和免疫组化染色（SP法）。具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。DAB显色封片后，高倍视野观察显色情况。TUNEL结果判定：肝细胞胞核黄染、固缩的为阳性细胞。免疫组化结果判定：Fas和Fasl、Caspase-8均为胞膜、胞浆着色，显示棕黄色颗粒的为阳性细胞。每张切片均随机观察5个视野，记数细胞总数和阳性细胞数，然后以阳性细胞数除以细胞总数，计算出阳性细胞的百分比，取5个视野的平均值。TUNEL的结果及为凋亡指数。

1.4 统计方法

采用SPSS 19.0统计软件包进行统计分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐用Dunnett’s T3法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 大鼠一般情况

正常对照组大鼠生长良好，毛发光滑，活泼好动，均存活。模型组大鼠毛发发黄，蓬乱，个别脱毛，体质量增加缓慢，喜群卧而不好动，嗜睡。造模结束时，因灌胃时酒精进入气管死亡5只，因其它不明原因死亡4只。各给药组大鼠一般情况好于模型组，但较正常对照组差。阳性药对照组和五田保肝液低、中、高剂量组因灌胃酒精呛入气管分别死亡4、6、3、5只，因其他不明原因分别死亡4、3、3、2只。

2.2 HE染色

正常组对照大鼠肝细胞以中央静脉为中心呈放射状分布，模型组可见部分肝细胞发生脂肪变性，肝小叶内可见少量点状坏死，门管区稍增宽，有少量纤维组织增生，淋巴细胞为主的炎细胞浸润。五田保肝液低剂量组和模型组病变差别不大，五田保肝液中、高剂量组和阳性药对照组病变相比模型组较轻。

2.3 五田保肝液对肝细胞凋亡的影响

实验结果表明：各组凋亡指数高于正常组（P＜0.01），五田保肝液中、高剂量和阳性药对照组凋亡指数低于模型组（P＜0.01），五田保肝液低剂量组和模型组差异没有显著性（P > 0.05）。见表 1。

2.4 五田保肝液对大鼠肝组织

Fas、Fasl蛋白表达的影响实验结果表明：各组Fas蛋白表达没有统计学差异，模型组Fasl、Caspase-8的表达高于正常对照组（P＜0.01）；五田保肝液低剂量组和模型组相比，虽然数值有下降趋势，但Fasl、Caspase-8的蛋白表达均无统计学意义（P > 0.05）；五田保肝液中、高剂量组和阳性药对照组Fasl、Caspase-8的表达低于模型组（P＜0.01），但高于正常对照组（P＜0.01）。见表 2。

3 讨论

随着酗酒人群的增加，ALD已经成为临床上的常见病、多发病，严重危害人类健康^[1-4]。ALD常发生连续并逐渐加重的肝损害，初期主要表现为脂肪肝，逐渐发展为酒精性肝炎、酒精性肝纤维化，严重甚至可发展为酒精性肝硬化^[5-7]。大量研究发现，酒精可通过复杂的机制导致肝细胞凋亡，这也是ALD发生、进展的重要机制之一^[8-10]。细胞凋亡是细胞在基因指导下的一步步走向死亡的过程，又叫程序性细胞死亡，属于细胞的“自杀”行为。生理情况下，某些细胞通过凋亡进行新老更替，但是在某些病理条件下，致病因子导致大量细胞发生凋亡，将引起组织的损伤，影响其形态和功能。目前认为主要有3条途径参与酒精造成的肝细胞凋亡^[11]：死亡受体、线粒体、内质网介导的凋亡通路。而Fas与Fasl是死亡受体信号通路中介导细胞凋亡最为重要的膜蛋白分子，直接启动细胞凋亡^[12-13]。Fas是一种细胞的跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子超家族成员，Fasl是它的天然配体，两者结合，Fasl传递死亡信号给Fas，激活的Fas和同样具有死亡功能域的受体连接蛋白（EADD）结合，进一步激活Caspase-8，从而启动了acspase家族酶级联反应，最终导致细胞凋亡^[14-17]。

五田保肝液是由垂盆草、田基黄、丹参等组成的复方中药，是国家药物发明的专利产品，专利号为021581703，以清肝化湿、解毒祛瘀、分化通经为治疗大法，经过长时间的临床验证，具有明确的防治ALD的功效^[18]，但具体发挥作用的机制并不清楚。

本实验研究发现，各组大鼠肝组织Fas的表达没有统计学差异，而模型组Fasl、Caspase-8的蛋白表达显著高于正常对照组，五田保肝液中、高剂量可降低Fasl、Caspase-8蛋白的表达。而各组的凋亡指数和Fasl、Caspase-8蛋白的表达相关联。Fasl的高表达，与Fas更多地结合，传递死亡信号，活化Caspase-8死亡信号复合物, 从而诱导肝细胞的凋亡。而五田保肝液可通过降低Fasl、Caspase-8蛋白的表达，从而抑制酒精造成的肝细胞凋亡，达到防治ALD的功效，以中、高剂量效果显著，低剂量作用不明显。