补肾活血法是基于其“本虚标实，虚实夹杂”之病机的中医治则。冠脉通片有活血化瘀、芳香开窍之功，又具补益肝肾之效。维生素D系统包括维生素D（VD）、相关酶和维生素D受体（VDR）。VDR除在肾脏表达外，还广泛表达于心血管系统。肾虚时，1α-羟化酶（CYP27B1）受损，VDR受体下调，从而影响机体心血管系统的正常工作。本文通过将冠脉通组方进行补肾及活血拆方，探讨冠脉通片通过作用于CYP27B1及VDR对补肾活血法的意义。

1 实验动物与材料 1.1 动物

65只雄性SD大鼠，8~9周龄成年鼠（250±10）g，购于北京大学医学部实验动物科学部。饲养于实验动物使用许可证环境中[许可证号：SYXK（津）2011-0003]。

1.2 药品和试剂

冠脉通片，由天津市同仁堂集团股份有限公司提供，受试样品为压片之前的小颗粒，批号为cj06017，质量标准参照部颁ws3-B-3619-98 19册，规格为棕褐色小颗粒，生药量为每克含2.926 5 g生药，0.3 g颗粒/片；补肾拆方：由同仁堂提供，规格为棕褐色小颗粒，生药量与冠脉通片全方中补肾成分含量相当；活血开窍拆方：由同仁堂提供，规格为棕褐色小颗粒，生药量与冠脉通片全方中活血开窍成分含量相当。腺嘌呤C5H5N5，购自上海润捷化学试剂有限公司，纯度≥98.0%，批号131101。使用前用1.0%羧甲基纤维素钠（CMC）配制成2%腺嘌呤混悬液。维生素D（阳性对照药），青岛双鲸药业有限公司，规格为：每粒含维生素A 3 000 U，维生素D 300 U，批号：140109，有效期为2016年1月8日，应用时用油作媒介，配制成1粒/ 20 mL使用。

1.3 仪器

小动物人工呼吸机（DH-150，浙江大学医学仪器厂），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，美国）；医用X射线胶片（柯达公司，美国）；高速离心机（Eppendorf公司，德国）；转移脱色摇床（海门其林贝尔仪器制造公司）；垂直电泳仪（BIO-RAD，美国）；恒温金属浴CHR-100；SHA-A水浴恒温振荡器：江苏金坛市环宇科学仪器厂；ChemlDoc XR5化学发光分析仪（BIO-RAD，美国）；凝胶玻璃板、固定夹（BIO-RAD，美国）；显微镜（奥林巴斯BX51T PHD-J11，日本）；CMOS（奥林巴斯，日本）；多功能真彩色细胞图像分析管理系统（Media Cybeznelics公司，美国）；石蜡切片机（莱卡RM2015，德国）。CYP27B1一抗（CST，美国，批号：L4025），VDR一抗（CST，美国，批号：L7354），β-actin（CST，美国，批号：L5466），羊抗兔IgG-HRP（批号：L64509）。

2 实验方法 2.1 模型制备方法

采用“腺嘌呤+左冠状动脉前降支结扎法”制备肾阳虚心梗模型，即灌胃腺嘌呤200 mg（/ kg·d），每日1次，连续3周，造成大鼠肾阳虚，然后行冠状动脉前降支结扎法（AMI）制备大鼠急性心肌梗死。将大鼠经4.5%戊巴比妥钠溶液按1 mL/kg腹腔注射麻醉后，背位固定于手术台上，无菌操作下沿大鼠左腋下与胸骨剑突连线处用刀片切开皮肤，逐层钝性分离肌肉，将面罩罩住大鼠口鼻连接人工呼吸机（参数设定为：呼吸比1:3，潮气量32，呼吸频率60），沿4、5肋间开胸，分离心包膜，挤出心脏至可见动脉圆锥，永久性结扎左冠状动脉前降支，心脏复位后立即制造胸腔负压状态，缝合肌肉皮肤。从而实现肾阳虚心梗的证候模型。假手术对照组采用“灌胃纯净水+AMI仅穿线不结扎法”。

2.2 分组及给药

除假手术对照组（A组）外，将肾阳虚大鼠按照随机数字表法随机分为肾阳虚心梗模型对照组（B组）、冠脉通片全方组（C组，2.6 g生药/kg，相当于临床人用剂量12倍）、补肾拆方组（D组，生药含量相当于全方补肾成分，为临床人用剂量12倍）、活血开窍拆方组（E组，生药含量相当于全方活血成分，为临床人用剂量12倍）、维生素D对照组（F组，300 U/kg）。采用预防性给药，于AMI术前2 d灌胃相应受试药物（A、B组给予饮用水），术前30 min给药1次，术后给药5 d，每日1次。

2.3 观察指标

1）肾阳虚评价指标：大鼠经4.5%戊巴比妥钠溶液按1 mL/kg腹腔注射麻醉后，暴露腹腔，腹主动脉取血，3 000 r/min离心10 min，分离血清。苦味酸速率法测定血清肌酐（Scr）、化学发光法测定血清三碘甲状腺原氨素（T3）、甲状腺素（T4）水平。2）血清活化1，25（OH）₂D₃ 水平：腹主动脉取血，3 000 r/min离心10 min，分离血清，酶联免疫法测血清活化1，25（OH）₂D₃ 水平。3）免疫组化法检测心室肌组织、肾组织VDR、肾组织CYP27B1表达：心室肌、肾脏组织标本固定48 h，常规石蜡切片脱蜡至水；3%双氧水封闭内源性过氧化物酶；酶法修复抗原；分别滴加CYP27B1一抗、VDR一抗；4 ℃过夜；加入二抗；二氨基联苯氨（DAB）显色，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照，半定量观察心室肌组织VDR、肾组织VDR和CYP27B1蛋白表达。多功能真彩色细胞图像分析管理系统采集图像。4）Western blot法检测心室肌组织、肾组织VDR和肾组织CYP27B1蛋白相对表达量：大鼠麻醉处死后，取心室肌及肾脏组织。以RIPA裂解液裂解组织，提取组织蛋白。二辛可宁酸（BCA）试剂盒进行蛋白定量，以每道10 μg上样进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜后，用5%脱脂奶粉封闭后分别加入一抗：β-actin一抗溶液配制（1:500）：脱脂奶粉封闭液5 mL，β-actin一抗10 μL；VDR一抗溶液配制（1:200）：脱脂奶粉封闭液10 mL，VDR一抗5 μL；CYP27B1一抗溶液配制（1:500）：脱脂奶粉封闭液5 mL，CYP27B1一抗10 μL；4 ℃摇床过夜，洗涤后加入HRP标记羊抗兔二抗，羊抗兔IgG-HRP溶液配制（1:7 500）：羊抗兔IgG-HRP二抗2 μL，牛奶封闭液15 mL；室温孵育1 h，采用化学发光底物进行化学发光，暗室曝光，显影定影后用BIO-RAD Quantity one图像分析软件进行扫描分析。

2.4 统计方法

应用SPSS 19.0软件包进行统计学分析。计量资料进行独立样本t检验，以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果 3.1 冠脉通拆方对大鼠肾阳虚心梗血清

Scr、T3、T4的作用比较肾阳虚心梗模型对照组Scr明显高于假手术对照组（P < 0.01），T3、T4低于假手术对照组（P < 0.05），冠脉通片全方降低Scr作用明显（P < 0.05），升高T3、T4作用显著（P < 0.05）。补肾拆方组和活血开窍拆方组降低Scr、升高T3、T4的作用均不明显（P > 0.05）。见表 1。

3.2 冠脉通拆方及全方对大鼠血清活化1，25（OH）₂D₃ 水平作用比较

肾阳虚心梗模型组血清1，25（OH）₂D₃ 水平较假手术对照组明显降低（P < 0.01），冠脉通片全方组可明显升高血清1，25（OH）₂D₃ 水平，与模型对照组比较有统计学差异（P < 0.05）。见表 1。

3.3 冠脉通拆方及全方对大鼠肾脏组织CPY27B1蛋白表达比较

与模型对照组比较，冠脉通片全方组肾组织CPY27B1蛋白表达明显增多，且全方和补肾拆方均可显著增加CPY27B1在肾中相对表达量（P < 0.01）。见表 2，图 1、2。

3.4 冠脉通拆方及全方对大鼠心脏和肾脏组织VDR蛋白表达比较

VDR在假手术对照组肾脏组织中有表达，模型对照组表达减少，补肾拆方与全方组VDR蛋白表达较模型对照组明显增多；各拆方组及冠脉通片全方组肾脏VDR蛋白相对表达量均明显高于模型对照组（P < 0.01）。VDR在心室肌有表达，除了冠脉通片全方组外，补肾拆方组也能有效增加心室肌VDR蛋白表达，蛋白质印迹数据可见相对VDR表达量明显高于模型对照组（P < 0.05），通过补肾组方可有效增加心室肌VDR。数据见 表 2，图 3-6。

4 讨论

冠脉通片临床应用已有多年，对临床心肌梗死治疗特色和临床定位是本文要解决的关键问题。通过对药味组成分析，冠脉通片具有补肾和活血两方面功效，用于肝肾不足、痰瘀阻络之胸痹。胸痹心痛病机为本虚标实，本虚即为肾虚，尤其是肾阳虚衰^[1]。因此，本研究对冠脉通片防治心肌梗死作用的研究突出补肾活血作用特点，动物模型采用灌胃腺嘌呤+左冠状动脉前降支法制备大鼠肾阳虚型心肌梗死证候模型^[2]，评价指标包括对缺血心肌保护和对肾阳虚两方面的综合作用。

本实验肾阳虚指标除血清肾功能指标外，甲状腺激素也是肾阳虚评价指标之一^[3]。甲状腺素是一种缓慢而长效的调节产热的激素，与机体能量代谢密切相关，其含量降低会出现甲状腺功能减低等一系列阳虚症状^[4]。甲状腺功能的降低在肾阳虚病机学中具有重要意义，临床肾阳虚患者血清T3、T4水平明显低于健康者^[5]。文献报道腺嘌呤诱导的肾阳虚模型T3、T4水平较氢化可的松诱导的肾阳虚模型偏低^[6]。故从反映甲状腺功能抑制的指标T3、T4上来看，腺嘌呤诱导的肾阳虚模型较氢化可的松诱导的肾阳虚模型更符合要求。

维生素D系统包括VD、相关酶、VDR，除了普遍认为的调节钙、磷代谢平衡的经典作用外，还广泛作用于皮肤、毛发、心脏、肌肉、神经、免疫细胞等组织细胞而发挥多种非传统作用，而中医认为肾虚证与VD缺乏关系密切，肾虚症候与骨质疏松临床表现非常相似^[7-9]。VD缺乏出现的类固醇激素、肾上腺皮质功能减退与中医肾虚症状和病理变化均有其共同之处^[10]。VD缺乏与慢性肾脏疾病患者生存率密切相关，肾功能进行性丧失会影响VDR的激活^[11]。

VDR除了在肾脏表达外，由于其在心血管系统内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞均表达，同时由于肾脏近曲小管上皮细胞CYP27B1在肾虚时受损，进而使血清1，25（OH）₂D₃ 降低、VDR减少。因此，VDR与CPY27B1成为联系心脏与肾脏之间的物质基础。已有研究表明，慢性肾脏疾病（CKD）发展中低VD与心血管并发症高死亡率关系密切^[12]。VDR激动剂对5/6肾切除致慢性肾损伤大鼠的心脏功能具有明确的益处^[13]，VDR具有调节肾素-血管紧张素系统、抑制心肌细胞增殖、抑制平滑肌细胞增殖、改善内皮细胞功能的作用，对肾素-血管紧张素、血管钙化、左心室肥大的抑制作用均可有效降低心血管死亡的风险^[14-15]。敲除VDR的小鼠可引发左心室肥厚和纤维化^[16]。

本实验以大鼠肾阳虚心梗证候模型为研究对象，采用拆方的方法，对补肾作用、活血开窍作用、冠脉通片补肾活血法予以比较研究。结果表明，冠脉通片全方的补肾、活血功效兼备，助肾阳以维持生命之本，活血开窍以化瘀除痹。本实验通过基础研究手段，对冠脉通片治疗心梗的证候特点提供药理学数据参考。

冠脉通片全方对血清1，25（OH）₂D₃ 有明显升高效果，同时对CPY27B1和VDR蛋白表达均有增加作用。除此之外，补肾拆方组对肾脏和心肌组织VDR蛋白的增加作用确切。这为将VDR作为核心环节，对冠脉通片用于肾虚血瘀的补肾活血作用机制提供了基础研究的数据支持。