20世纪末中国进入老龄化社会，人口老龄化问题成为新的挑战。随着经济的日益发展，人们开始关注衰老方面的研究。衰老过程是复杂的，原因多样，关于衰老的学说更是各不相同，有自由基学说、线粒体学说、遗传学说等，其中比较公认的是自由基学说。通过国内外研究发现，中医药大多从健脾补肾方向开展抗衰老研究。

近年来，谭万信教授等^[1]根据《素问·上古天真论》中“女子七岁，肾气盛，齿更发长……五七，阳明脉衰，面始焦，发始堕”的论述，提出补益阳明津气可以延缓女性衰老，并取得一定的进展。研究提示，益胃养阴生津的代表方益胃汤能够通过改善中枢神经递质功能紊乱的状态，调节神经内分泌功能，进而延缓初老雌鼠生殖轴衰老^[2]。益胃汤组成药物有北沙参、麦门冬、冰糖、细生地、玉竹。本实验旨在从蛋白质水平探索益胃汤对下丘脑的调节作用，筛选并分析大鼠下丘脑具有显著差异表达的蛋白，进一步探寻益胃汤延缓衰老的分子机制。

1 材料与仪器 1.1 动物

SD雌性大鼠30只，月龄10~12个月和4~6个月：由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。许可证号：scxk(京)2014-0004。

1.2 药物及试剂

北沙参、麦门冬、细生地、玉竹、生理盐水(淄博市中西医结合医院)；冰糖(百货商店)；尿素(Urea)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、IPG buffer、甲酸(FA)(美国GE公司)；十二烷基磺酸钠(SDS)、三羧基氨基甲烷(Tris)、三氯乙酸(TCA)、过硫酸铵(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)(美国Amresco公司)；三乙二胺碳酸盐(TEAB)、考马斯亮蓝G-250(美国Sigma公司)；胰蛋白酶(美国Promega公司)；乙腈(ACN)、水等(美国Thermo公司)。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器

Sciex Triple TOF 5600质谱仪(美国SCIEX公司)，配有纳升喷雾Ⅲ离子源(美国SCIEX公司)，Eksigent nanoLC-1D plus液相系统(美国SCIEX公司)以及Analyst TF 1.6数据处理软件；Eppendorf冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；ImageScanner扫描仪(美国GE Healthcare公司)；真空冷冻干燥机(美国Thermo公司)；超声波细胞粉碎机VCX130(美国Sonics公司)；电泳仪Mini PROTEAN tetra Cell(美国Bio-Rad公司)。

2 实验方法 2.1 动物分组及建模

30只健康雌性大鼠，普通饲料常规喂养。去势组(4~6月龄)采用10%苯巴比妥，60 mg/kg ip，将大鼠麻醉成功后，切除双侧卵巢。切除卵巢24 h后进行阴道细胞学涂片，每日1次，连续5 d，若阴道角化细胞指数低于50%，则造模成功。同时初老组(10~12月龄)亦作阴道细胞学涂片，方法时间同去势组相同，若阴道角化细胞指数高于50%，则为初老模型。正常组(10~12月龄)每天作阴道细胞学涂片，每日1次，连续5 d，以阴道角化细胞指数高于50%者为正常模型。

2.2 给药方法

两组均以益胃汤27 g/(kg·d)进行灌胃，正常组以生理盐水13.5 mL/(kg·d)进行灌胃，连续灌胃4周。末次灌药结束24 h后断头处死，取大鼠下丘脑组织。

2.3 下丘脑组织处理

采用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术分离、分析、鉴定大鼠下丘脑差异蛋白：1)蛋白提取和定量，本样品浓度测定采用BCA蛋白浓度测定方法^[3]；2)胰蛋白酶酶解及标记；3)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

3 结果 3.1 蛋白浓度测定结果

测定方法为聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白浓度测定方法，结果见表 1。

3.2 SDS-PAGE结果

用ImageScanner扫描仪扫描染色后的凝胶，SDS-PAGE测定结果见图 1。

3.3 可信蛋白及差异蛋白筛选结果

酶解标记后的下丘脑蛋白样品利用液质联用技术进行分析，分析后进行数据库检索。对得到的检索结果按照Unused > 1.3且peptide≥1，并去除空白值和反库数据的标准筛选可信蛋白，筛选结果为：可信蛋白3 706个。计算得到每一比较组的差异倍数Fold Change(FC)值和差异显著性P值，以FC > 1.5或FC < 2/3且P < 0.05为标准筛选差异显著蛋白，筛选结果初老组差异蛋白96个，去势组差异蛋白95个。图 2和图 3分别为初老组和去势组下丘脑差异蛋白火山图。对初老组和去势组的差异蛋白取并集得到动态变化蛋白173个。通过检索Uniprot数据库，筛选出与衰老相关的蛋白共7个。其中，显著上调者：纤溶酶原(plasminogen)、α-晶体蛋白B链(α-crystallin B Chain)、血清转铁蛋白(serum transferrin)、非常规肌球蛋白-Id(wnconventional myosin Id)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、蛋白质Fbxo4(4 Grotein Fbxo44)；显著下调者：Hsp70结合蛋白1(Hsp Toblinding protein 1)。

3.4 KEGG通路检索结果

通过检索KEGG Pathway Maps数据库，发现神经活性配体-受体相互作用、补体和凝血级联、长寿调节途径(多种)、HIF-1信号通路、磷酸酶活性的负调控通路、细胞黏附、适应性免疫系统、抗原处理、泛素化和蛋白酶体降解、Ⅰ类MHC介导的抗原加工和呈递、免疫系统等通路与衰老有直接或间接的联系。

4 讨论

通过对正常组、初老组和去势组下丘脑蛋白质平均含量的综合比较，最终确定在对初老雌鼠生殖机能衰老的影响上，共有7种具有显著差异的蛋白质，它们分别为plasminogen、α-crystallin B chain、Hsp70 binding protein 1、serum transferrin、unconventional myosin-Id、myelin oligodendrocyte glycoprotein、protein Fbxo44。通过FC值比较发现，其中除了Hsp70 binding protein 1之外的其他蛋白，在初老组中表达较去势组更显著，表明益胃汤对初老组干预作用较去势组明显。这些差异蛋白主要涉及免疫系统、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤发生、蛋白的转运和催化、蛋白的代谢等过程，这些过程与衰老存在直接或间接的联系。

4.1 上调的差异蛋白基因(GO)分析和KEGG通路的讨论分析 4.1.1 纤溶酶原

纤溶酶原参与肿瘤侵袭和炎症反应，纤溶酶原对应基因为Plg，参与的KEGG通路有神经活性配体-受体相互作用，补体和凝血级联。卢根林等^[4]通过临床研究发现，急性胰腺炎(AP)患者血浆Plg活性减低明显。Liu等^[5]通过实验研究发现，在鱼藤酮诱导的帕金森病(PD)模型中，Plg可以通过恢复凋亡和自噬之间的平衡对PD起到治疗作用。Per Svenningsen等^[6]研究发现，一些具有肾表达的纤溶酶原被表面受体激活后，可以通过在肾中表达的蛋白酶活化受体PAR发挥作用，并且对肾脏疾病的组织重塑和炎症有一定的意义。本实验研究发现，益胃汤对Plg在蛋白酶激活过程中的作用是上调的。笔者认为，Plg表达的提高，可能会增加细胞表面蛋白酶活化受体PAR的数量，诱发凝血反应、促进细胞释放炎症介质或细胞因子，对局部炎症反应或细胞凋亡进行调控，这可能是益胃汤延缓初老雌鼠生殖机能衰老的作用机制之一。

4.1.2 α-晶体蛋白B链

α-晶体蛋白B链对应基因为Cryab，参与老化、凋亡过程涉及形态发生，活性氧代谢过程负调节。细胞衰老与纤维化、炎症以及癌症等多种疾病有着密切的关系^[7]。α-晶体蛋白B链^[8]广泛存在于多种细胞中，属于小分子热休克蛋白家族，因此其亦具有热休克蛋白家族的基本功能。α-晶体蛋白B链参与抗细胞凋亡过程，研究者发现，其能抑制由细胞抵抗高温、射线，缺氧，药物等多种因素引起的细胞凋亡^[9]。慢性炎症是衰老进程中主要的病理表现，唐蜜^[10]研究发现多巴胺受体D2可通过调节Cryab发挥抑制神经炎症的作用。通过本实验和KEGG通路查阅发现，在益胃汤的作用下，Cryab的表达是上调的，笔者认为益胃汤可能具有抗细胞凋亡的作用，同时亦具有多巴胺受体D2类似的作用，可以通过调节Cryab表达干预炎症反应，延缓衰老。

4.1.3 血清转铁蛋白

血清转铁蛋白对应基因为Tf，参与急性期反应、铁凋亡、细胞凋亡、少突胶质细胞祖细胞增殖的正调控，参与ephrin-ephrin受体双向信号轴，参与的KEGG通路为HIF-1信号通路。HIF-1是一种转录因子，其作为氧稳态的主要调节剂起作用。王银芳^[11]在研究中指出，低氧可以诱导自噬，而且主要是通过HIF-1α/BNIP3信号通路实现的，同时低氧自噬与细胞的凋亡、侵袭性以及肿瘤的发生等具有重要关系。袁玉梅^[12]研究发现修复衰老大鼠海马神经元完整自噬流可以抵抗应激损伤，延缓衰老的进程。同时，Tf可以促进机体内铁凋亡，减少铁蓄积，增加抗氧化应激酶活性，缓解氧化应激^[13]。而从本实验益胃汤对基因表达的结果来看，Tf在HIF-1信号通路中是上调表达，进而笔者认为益胃汤延缓初老雌性大鼠衰老的机制之一，可能是通过增加机体内氧的运输量，从而降低低氧自噬的发生，减少了细胞凋亡。

4.1.4 非常规肌球蛋白-Id

非常规肌球蛋白-Id对应基因为Myo1d，涉及前脑发育，细胞定位，参与磷酸酶活性的负调控通路。镐振选^[14]在研究中指出，多个和衰老相关的基因已经被证实和血管功能障碍有关，其中存在于树突及神经元胞体中的基因KNDC1，具有蛋白磷酸酶活性，而既往研究证明KNDC1mRNA转录及KNDC1蛋白表达在衰老的HUVECs中有所增加，同时发现敲低KNDC1的表达后，内皮细胞的衰老亦得到延缓。笔者认为益胃汤可能作用于磷酸酶活性的负调控通路，通过干预非常规肌球蛋白-Id表达对具有磷酸酶活性的KNDC1进行抑制，从而延缓大鼠血管内皮细胞衰老。邢方凯^[15]在研究中指出，非常规肌球蛋白在调节神经系统突触可塑性中起重要作用，而突触是防治与脑老化相关的神经退行性疾病的靶点^[16]，因此笔者认为非常规肌球蛋白-Id的显著表达有利于延缓神经系统衰老，亦可能是延缓初老雌鼠衰老的机制之一。

4.1.5 髓鞘少突胶质细胞糖蛋白

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白对应基因为Mog，参与老化与细胞黏附。近年来，研究发现髓鞘少突胶质细胞糖蛋白与中枢神经系统炎性疾病相关，神经炎症是一种免疫应答反应，可以活化神经细胞促使其释放炎症介质，并形成毒性循环，致使神经退行性改变，导致神经细胞萎缩，细胞间突触联系和蕴藏的生化物质减少，机体接受和传递信息的能力降低，出现感觉迟钝，反应缓慢，记忆力下降，思维阻滞，脑功能降低的现象，这就是所谓的“脑老化”^[17]。孙梦雅等^[18]也表示，抑制Mog基因及蛋白表达可能是宫内炎症致新生大鼠脑组织损害的机制之一。因此笔者认为，该基因的下调可能是导致神经炎症和“脑老化”的因素之一，而益胃汤很可能是通过上调该基因表达，阻止或延缓神经炎症和“脑老化”的发生，从而延缓初老雌鼠生殖轴的衰老。

4.1.6 蛋白质Fbxo44

蛋白质Fbxo44对应基因为Fbxo44，与泛素-蛋白转移酶活性的蛋白质的编码有关，参与蛋白酶体蛋白分解代谢过程，参与的KEGG通路有适应性免疫系统、抗原处理、泛素化和蛋白酶体降解、Ⅰ类MHC介导的抗原加工和呈递、免疫系统。高歌^[19]通过研究发现Fbxo44在乳腺癌中具有高表达倾向，并推测可能有助于乳腺癌的发展。Benita Sjögren^[20]通过免疫沉淀发现Fbxo44可以通过Cullin 4B/DDB1复合体CUL4B/ DDB1/FBXO44 E3连接酶介导RGS2的降解，而RGS2与多种恶性肿瘤的发生、发展有关。研究发现，癌基因的活化可以诱导细胞衰老，称为癌基因诱导的细胞衰老^[21]。因此笔者认为益胃汤可能通过干预Fbxo44的表达，在一定程度上抑制了癌基因的活化和恶性肿瘤的发生，影响了细胞衰老进程，从而间接地延缓了初老雌鼠的衰老。

4.2 下调的差异蛋白基因(GO)分析和KEGG通路的讨论分析

Hsp70结合蛋白1对应基因为Hspbp1，参与的KEGG通路为内质网蛋白质加工。宋砚坤等^[22]通过研究发现Hsp70可以与抗凋亡基因Bcl-2结合调控细胞凋亡、增殖和信号传导。褚晓蕾等^[23]通过动物实验研究发现并推测，HSP70与Apaf-1结合量的增强可能是抑制骨骼肌细胞凋亡的机制之一。在生物的应激细胞中Hsp70结合蛋白常处于高度诱导状态，以保护机体和细胞。在本实验研究中发现Hspbp1在参与内质网相关性降解过程中是下调表达，益胃汤可能是通过抑制内质网相关性降解过程中Hspbp1的表达，避免内质网功能紊乱的发生，若内质网功能持续紊乱，细胞将启动caspase12依赖的细胞凋亡程序，这些反应被统称为未折叠蛋白质应答(UPR)^[24]。Hspbp1的表达下调很可能可以抑制细胞启动凋亡程序，避免细胞死亡，这可能是益胃汤延缓初老雌鼠衰老的机制之一。

5 小结

纵观整个课题，蛋白质组学技术和动物模型的建立是关键部分。在初老模型动物选择方面，根据前人经验，考虑到益胃汤干预衰老的时间点应该在“五七”之前，即“未老先防”，因此本课题选择生殖生理内环境接近女性“五七”之年的10~12月龄SD雌鼠进行研究。结果表明，益胃汤延缓初老雌鼠生殖机能衰老的可能机制有：抗炎症反应、抑制细胞凋亡、减少肿瘤的发生，该结论亦为本课题后续的深入研究奠定了基础。