2018, Vol. 35文章信息
- 李泽争, 王利, 曹爱丽, 彭文
- LI Zezheng, WANG Li, CAO Aili, PENG Wen
- 白藜芦醇对高糖诱导足细胞损伤的改善作用及机制探讨
- Protective effect and mechanisms of resveratrol on hyperglycemia-induced podocyte apoptosis
- 天津中医药, 2018, 35(10): 778-782
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2018, 35(10): 778-782
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2018.10.16
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文章历史
- 收稿日期: 2018-06-08
糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的微血管并发症，亦是导致终末期肾脏衰竭(ESRD)的重要原因[1-2]。足细胞是一种高度分化的细胞类型，在维持肾小球结构、构成肾小球滤过屏障方面发挥着重要作用。有研究证实，足细胞损伤在DN发展过程中意义重大[3-4]。越来越多的研究证明足细胞数量及形态的变化可预测DN的发生发展，抑制足细胞的损伤可能会阻止或减缓DN的疾病进程，但目前为止足细胞损伤的机制仍不明确，亦缺乏有效防治足细胞损伤的干预手段。
白藜芦醇(RSV)是一种植物抗毒素，有研究发现RSV可显著降低蛋白尿，具有明确的肾脏保护功能，此外其在保护足细胞方面也表现出巨大潜力[5]，然而活化过程尚未完全明确。本研究采用体外高糖诱导足细胞损伤模型，观察RSV对足细胞损伤的保护作用及涉及的可能分子机制，以期为临床上防治DN提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验主要材料FBS、胰酶、RPMI1640培养基(美国Gibco公司)；RSV(上海同田生物技术股份有限公司)；二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(美国BD公司)；dihydroethidium(美国Sigma公司)；JC-1、MitoSOX Red (美国Thermos Fisher Scientific公司)；β-actin、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3、caspase 9(美国Cell Signaling Technology公司)。RSV溶于DMSO(终浓度≤0.1%)中，配置成储存液，避光，4℃保存。
1.2 方法 1.2.1 足细胞培养永生化小鼠足细胞株是从H-2Kb-tsA58转基因小鼠肾脏分离后建立的细胞系，由美国Mount Sinai医学院Mundel教授授权，上海交通大学附属第六人民医院汪年松教授转赠，传代数≤15代。
1.2.2 细胞分组及干预方法1) 对照组：5 mmol/L低糖培养液(LG)；2)模型组：30 mmol/L高糖培养液(HG)；3) RSV干预组：①HG+5 μmol/L RSV；②HG+10 μmol/L RSV，RSV提前干预2 h后高糖孵育48 h。
1.2.3 细胞凋亡检测足细胞接种于6孔板，细胞干预结束后，消化收集细胞，磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗2次，加入200 μL 1×Binding Buffer混匀，避光加入5 μL Annexin V，室温放置15 min，加入PI 5 μL，重悬细胞上流式细胞仪进行检测。
1.2.4 ROS检测DHE稀释至无血清培养基，终浓度为10 μmol/L。细胞干预结束后，吸弃培养基，PBS洗涤2次，加入稀释的DHE，37 ℃孵育20 min，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，即刻置荧光显微镜下观察。
1.2.5 JC-1染色足细胞接种于内置无菌细胞爬片的6孔板，干预后吸弃培养基，PBS洗涤2次，加入2 μmol/L JC-1，37 ℃孵育30 min，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，封片，置荧光显微镜下观察。
1.2.6 MitoSOX染色足细胞接种于内置无菌细胞爬片的6孔板，干预后吸弃培养基，PBS洗涤2次，加入稀释的5 μmol/L MitoSOX，37 ℃孵育10 min，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，封片，置荧光显微镜下观察。
1.2.7 Western blot检测细胞干预结束后加入蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂)充分裂解，高速低温离心留取上清，提取蛋白并检测含量，取等量蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，室温摇床封闭1 h，依次加入一抗(β-actin、caspase 3、caspase 9)，4 ℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温摇床1 h，在Image QuantLAS 500成像系统中进行显影。以β-actin的蛋白表达为内参照，结果以靶蛋白/内参的灰度比值表示，实验重复3次，取平均值。
1.3 统计学分析采用SPSS 20.0统计分析软件，计量资料以均数±标准差(x±s)形式表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 RSV对高糖诱导足细胞的保护作用流式细胞仪检测结果显示，高糖孵育可显著提高足细胞的早期凋亡与晚期凋亡。与HG组相比，RSV干预后，细胞凋亡出现不同程度的抑制，且随着药物浓度升高，抑制作用逐渐增强，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。见图 1，表 1。
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| 图 1 RSV对足细胞凋亡的影响 Fig. 1 Effect of RSV on podocyte apoptosis 与LG组比较，#P＜0.05；与HG组比较，*P＜0.05 |
ROS在足细胞损伤中发挥重要作用，本研究采用荧光探针DHE观察足细胞内ROS生成情况。结果显示，与LG组相比，高糖孵育可明显提高细胞内ROS生成，且RSV可剂量依赖性的抑制高糖诱导的ROS表达水平。见图 2。
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| 图 2 RSV对细胞内ROS生成的影响（倒置荧光显微镜×200） Fig. 2 Effect of RSV on the intracellular ROS generation(inverted fluorescence microscope ×200) |
线粒体膜电位下降发生在线粒体功能障碍的早期，本研究以JC-1荧光探针检测线粒体膜电位。当线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体基质中，以聚合体形式呈现，产生红色荧光；当线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体基质中，以单体形式呈现，产生绿色荧光。激光共聚焦结果显示，RSV干预后，绿色荧光向红色荧光转变增多，提示RSV可有效抑制高糖诱导的线粒体膜电位下降。见图 3。
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| 图 3 RSV对线粒体膜电位的影响（激光共聚焦×400） Fig. 3 Effect of RSV onmitochondrial membrane potential(laser confocal ×400) |
采用线粒体超氧阴离子染料MitoSOX检测线粒体ROS。结果提示高糖可显著提高足细胞线粒体ROS的产生，RSV可剂量依赖性的降低线粒体ROS的表达水平。见图 4。
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| 图 4 RSV对线粒体ROS的影响（激光共聚焦×400） Fig. 4 Effect of RSV onROS generation inmitochondrial(laser confocal ×400) |
与LG组相比，HG组cleaved caspase 3、cleaved caspase 9表达水平显著上调；随RSV干预浓度的提高，与HG组相比，cleaved caspase 3、cleaved caspase 9表达水平逐渐降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见图 5。
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| 图 5 RSV对线粒体凋亡途径相关蛋白的影响 Fig. 5 Effect of RSV on protein related to mitochondrial apoptosis pathway 与LG组比较，#P＜0.05；与HG组比较，*P＜0.05 |
DN是一种糖尿病的长期并发症，以蛋白尿和肾小球硬化为病理特征，临床中约40%的Ⅰ型及30%的Ⅱ型糖尿病患者最终会发展为DN。足细胞又称为脏层肾小球上皮细胞，与内皮细胞、肾小球基底膜共同构成肾小球滤过屏障。研究表明，DN早期便伴有足细胞损伤，表现为足细胞密度的降低和数量的减少。由于足细胞增生分化能力有限，凋亡是足细胞丢失的主要原因。至目前为止，引起足细胞凋亡的因素很多，但机制复杂，是当前肾病学科的研究热点。因此，探讨足细胞凋亡机制及有效干预手段对寻求治疗DN具有重大意义。近年来，RSV用于治疗肾脏疾病越来越受到学者们的关注。有研究证实在STZ诱导的Ⅰ型DN中，RSV可显著降低蛋白尿水平，改善肾脏病理损伤[6]。RSV可通过激活SIRT1/PGC-1α途径，改善线粒体功能障碍，从而减轻醛固酮诱导的蛋白尿及足细胞损伤[7]。探讨RSV对足细胞凋亡的保护作用及潜在分子学机制，为DN的防治研究提供了新方向。
本研究采用体外高糖孵育模拟糖尿病体内环境，结果表明RSV可显著抑制高糖诱导的足细胞凋亡，并呈量效关系，这可能是其可降低蛋白尿的机制之一。同时，实验结果显示RSV可显著降低细胞内及线粒体ROS的合成、提高线粒体膜电位、下调cleaved caspase 3及cleaved caspase 9的表达水平，提示RSV对足细胞的保护作用可能是通过抑制氧化应激，改善线粒体功能障碍实现的。
足细胞作为一种终末分化细胞，对ROS异常敏感，高糖刺激时氧化和抗氧化系统的失衡及ROS产生过多是导致足细胞损伤的主要机制之一[8-9]。ROS不仅可以直接损伤足细胞，还可激活NADPH氧化酶产生更多的ROS，从而形成恶性循环[10]。有学者更是提出在糖尿病早期，高糖即可通过ROS启动足细胞凋亡，诱导其从基底膜脱落，降低肾小球内足细胞数量，出现蛋白尿[11]。以上研究均提示氧化应激可能是DN中足细胞损伤的重要机制之一。本研究中，RSV干预可显著降低细胞内ROS生成，改善高糖诱导的细胞凋亡，表现了显著的抗氧化作用。近年来，RSV的抗氧化作用日益成为肾脏病领域的研究热点，研究显示RSV可显著降低糖尿病大鼠肾组织中ROS及MDA水平，减少细胞凋亡[12]。在高糖刺激的系膜细胞中，RSV可激活SIRT1，减少高糖诱导的氧化应激对线粒体的损伤[13]。可见，RSV作为一种具有抗氧化作用的中药单体，在转化为公认抗氧化剂发面具有巨大潜力。
线粒体是真核细胞能量供应的最重要细胞器，通过氧化磷酸化途径产生机体内大部分ATP，同时它也是ROS生成的主要来源，亦是ROS的作用靶点[14-15]。ROS可损伤线粒体的酶类、脂类和核酸，进一步导致ROS合成增加。同时，ROS还可对线粒体DNA产生氧化损伤，导致线粒体ATP合成减少、线粒体膜电位破坏等结构和功能的改变，因此ROS增多也是线粒体功能障碍的表现之一。综上，氧化应激与线粒体功能密切相关，亦有研究显示高糖诱导的氧化应激是由线粒体依赖的通路介导的。本研究发现RSV干预可显著降低足细胞线粒体内ROS的生成，提高线粒体膜电位，改善线粒体功能障碍。线粒体功能障碍可引发内源性的线粒体凋亡途径，首先表现为线粒体膜通透性转换孔道的开放，进一步引起线粒体膜去极化，凋亡前因子如细胞色素c释放入胞浆，进而激活caspase 3、caspase 9等细胞凋亡蛋白。本实验中，RSV可显著降低cleaved caspase 3及cleaved caspase 9的表达水平，改善足细胞凋亡，提示RSV可通过改善线粒体功能障碍抑制内源性的线粒体凋亡途径。综上所述，RSV可通过抑制氧化应激，改善线粒体功能障碍抑制高糖诱导的足细胞凋亡。然而，RSV如何靶向降低ROS的生成、提高线粒体膜定位、抑制线粒体依赖性的凋亡途径，值得更加深入的探索与研究。
研究结果表明RSV呈浓度依赖性的抑制高糖诱导的足细胞凋亡，其保护作用可能与抑制氧化应激，改善线粒体功能障碍相关。以此推测RSV可用于预防足细胞损伤，在DN的防治方面具有广大空间。当然，这一推论还有待于动物实验及临床研究进一步证实。
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