2018, Vol. 35文章信息
- 李谚语, 刘丽, 范颖, 李军, 张英利, 卢健
- LI Yanyu, LIU Li, FAN Ying, LI Jun, ZHANG Yingli, LU Jian
- 保肝汤对小鼠四氯化碳致慢性化学性肝损伤的保护作用
- Protective effect of Baogan decoction on chronic chemical liver injury induced by carbon tetra chloride in mice
- 天津中医药, 2018, 35(12): 935-938
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2018, 35(12): 935-938
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2018.12.17
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文章历史
- 收稿日期: 2018-07-20
肝脏是人体主要的代谢器官，肝损伤常见的原因有病毒感染、创伤、及化学中毒等[1]。据统计，全世界每年10万人中约有13.9~24.0人发生药物性肝损[2]。因此寻求抗肝损伤，抗肝纤维化的药物日益受到关注。保肝汤由黄芪、葛根、枸杞子、五味子等组成，具有疏肝理气、清热解毒的功效。本研究旨在分析中药保肝汤对四氯化碳（CCl4）致慢性化学性肝损伤小鼠的肝脏保护作用。
1 材料 1.1 实验动物SPF级昆明种小鼠84只，雄性，体质量20~25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。
1.2 实验药物保肝汤：由黄芪、葛根、枸杞子、五味子等组成（饮片购自辽宁中医药大学附属医院）。用10倍蒸馏水浸泡上述饮片30 min，煎煮1 h，过滤，取滤液；再加8倍蒸馏水于药渣，煎煮40 min，过滤，取滤液；合并两次煎煮滤液，浓缩，分别配置高、中、低剂量灌胃药液，备用。其中高、中、低剂量组灌胃药液浓度分别为含生药0.024 g/mL、0.012 g/mL、0.006 g/mL。护肝片：由柴胡、茵陈蒿、板蓝根、绿豆、五味子、猪胆粉组成（批号：201405080，购自黑龙江葵花药业股份有限公司）。将护肝片配制成浓度为含生药0.006 g/mL的溶液，备用。
1.3 主要试剂丙氨酸转氨酶（ALT）测试盒（1113051，南京建成生物工程研究所）；天冬氨酸转氨酶（AST）测试盒（CH0105202，南京建成生物工程研究所）；丙二醛（MDA）测试盒（20140530，南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（20140529，南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：201404，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；甘油三酯（TG）测试盒（批号：1213061，南京建成生物工程研究所）。
1.4 主要仪器与设备电子天平（ALC-210.3，赛多利斯科学仪器）；台式高速大容量冷冻离心机（TGL20M-Ⅱ，湖南省凯达实业以展）；台式高速冷冻离心机（Neofuge 13R，上海力申科学仪器）；全自动生化仪（TBA-40FR，日本东芝）；-80 ℃冰箱（DW-HL38，中科美菱）；电热恒温培养箱（SHA-C，常州国华电器）。
2 实验方法 2.1 分组方法将84只昆明小鼠随机分为6组，即正常组、模型组、护肝片组、保肝汤高剂量组、保肝汤中剂量组、保肝汤低剂量组，每组14只。
2.2 造模与给药方法适应性喂养1周后，除正常组外，其余各组分别在实验第1、3、10、16、22、25、28天腹腔注射0.5% CCl4；于造模后第10天开始灌胃，其中正常组和模型组给予蒸馏水（0.01 mL/g）灌胃，护肝片（0.5 g/kg）及保肝汤高剂量组（32 g/kg）、保肝汤中剂量组（16 g/kg）、保肝汤低剂量组（8 g/kg）分别给予灌胃药液。第30天灌胃2 h后称质量，腹主动脉取血，于肝左、右中叶、尾状叶各取材1块，置于4%多聚甲醛溶液中固定，待测病理；将取材后的肝脏以冷生理盐水冲洗后，置低温冰箱保存，待测指标。
2.3 病理组织学检测及肝脏指数计算病理组织学检测：取4%多聚甲醛溶液中固定的肝组织用石蜡包埋、切片、苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察。
计算肝指数：肝脏指数＝肝脏质量/进食体质量[3]。
2.4 指标测定采用基于IFCC2002配方法检测血清ALT、AST的活性；采用抽提法测定SOD，采用TBA法测定MDA含量；严格按试剂盒操作。
2.5 数据处理采用SPSS 19.0统计软件进行分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。
3 结果 3.1 对肝组织病理的影响在光学显微镜下观察，模型组中央静脉和肝细胞形态、结构变形明显，肝细胞肿胀，细胞核变大，肝细胞界限不清，有的部位核仁消失，可见多处大片肝细胞脂肪变性，并见多处灶状坏死。表明实验造模成功。保肝汤各剂量组与模型组比较在肝组织形态及结构上均有所改善，中、低剂量组肝组织镜下改变明显肝组织形态结构接近正常，散见肝细胞脂肪变性。见图 1。
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| 图 1 保肝汤对小鼠肝组织形态的影响（肝组织HE, ×400） Fig. 1 Effect of Baogan Decoction on the morphology of liver tissue of mice (HE, ×400 of liver tissue) A.正常组B.模型组C.护肝片组D.保肝汤高剂量组E.保肝汤中剂量组F.保肝汤低剂量组 |
与正常组相比，模型组及保肝汤高、中、低剂量组肝指数升高明显（P < 0.05）；与模型组比较，保肝汤无统计学差异（P＞0.05）。见表 1。
与正常组比较，模型组ALT明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，保肝汤高、中、低剂量组ALT均明显降低（P＜0.05）。保肝汤中剂量组比低剂量组明显降低（P < 0.05）。见表 2。
与正常组比较，模型组AST显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型组比较，保肝汤中剂量组AST明显降低（P < 0.05）；保肝汤中剂量组AST值低于保肝汤低剂量组（P＜0.05）。见表 2。
3.3.3 对AST/ALT的影响与模型组比较，保肝汤高、中、低剂量组均显著升高（P < 0.05）。见表 2。
3.4 保肝汤对实验小鼠血清SOD、MDA、TG的影响 3.4.1 对SOD的影响与模型组比较，保肝汤高、中、低剂量组SOD值均有升高趋势，但无统计学意义（P＞0.05）。保肝汤中剂量组与正常组比较显著升高（P＜0.05）。见表 3。
与正常组比较，模型组MAD值明显升高（P < 0.05）。与模型组比较，保肝汤中剂量组和低剂量组显著降低（P < 0.05）。保肝汤高剂量组和中剂量组比较显著升高（P < 0.05）。见表 3。
3.4.3 对TG的影响与模型组比较，保肝汤高剂量组和低剂量组显著升高（P < 0.05）。保肝汤低剂量组TG值明显高于保肝汤中剂量组（P < 0.05）。见表 3。
4 讨论CCl4是化学性肝毒剂，腹腔注射能引起实验动物膜通透性增加，细胞内的酶释放，其分子中的三氯甲基基团经催化后形成三氯甲基过氧化基团，引起了肝细胞脂质过氧化反应，进而导致肝脏损伤及肝功能异常[4-5]。本实验通过复制CCl4致慢性化学性肝损伤模型，研究保肝汤对CCl4致慢性化学性肝损伤的保护作用。
ALT和AST是反映肝损伤程度的指标[6]，其中ALT是最常用的判断肝细胞是否受损的敏感指标；AST大幅度升高意味着肝细胞损伤的程度比较严重[7]。AST/ALT比值增大，说明肝细胞损伤程度严重且认为是慢性化程度加重的标志[8]。本研究中，保肝汤高、中、低剂量组ALT水平较模型组明显降低。保肝汤高、中、低剂量组AST水平均较模型组降低，其中保肝汤中剂量组最低。保肝汤高、中、低剂量组AST/ALT值较模型组均升高。结果表明保肝汤对小鼠肝损伤有一定保护作用；保肝汤中剂量降低肝细胞的损伤程度在保肝汤3组中效果最好；在肝损伤慢性化程度进展上保肝汤各剂量组均无明显作用。
SOD是一种抗氧化酶，SOD的活性可以反映自由基的清除率。MDA是脂质过氧化的主要产物，间接反应肝损伤程度[9-11]。TG在肝脏、脂肪等组织中进行合成，肝脏也将血液中的糖类转化为TG。本研究中，模型组SOD稍升高，和空白组比较无统计学差异，这与其他实验研究趋势不同[12-13]，考虑是CCl4进入机体后激活了机体的氧化应激信号通路，引起SOD应激性升高。实验结果显示，保肝汤中剂量组SOD明显升高，MDA值最低，可见，保肝汤中剂量组的脂质过氧化产物最少，脂质过氧化程度最轻，对清除自由基、抑制自由基启动脂质过氧化反应效果最好。此外，保肝汤高剂量组和低剂量组与模型组比较TG值显著升高，说明保肝汤高、低剂量组对肝脏的作用倾向于提高肝脏对TG的合成。
由此可见，保肝汤能够减轻CCl4对小鼠肝细胞的损伤程度，并具有一定的保肝作用，其中，以保肝汤中剂量组作用最优；作用机制与抑制肝损伤后脂质过氧化反应有关。
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