1 研究背景

冠心病稳定型心绞痛主要诱因有饮食、吸烟、饮酒、体质量过高、运动过少、高血压以及糖尿病等^[1]。近年来，本病发病率以及病死率居高不下，并且随着年龄的增高呈上升趋势^[2-3]。《2016年中国卫生和计划生育统计年鉴》中指出中国城市和农村居民冠心病稳定型心绞痛病死率分别为110.67/10万和110.91/10万^[4]。

中医学将冠心病稳定型心绞痛归于胸痹、心痛范畴。毛静远等^[5]通过对全国范围冠心病中医临床流行病学调查发现，通过中医辨证治疗的冠心病患者血瘀、痰浊等标实证候要素及相关的证候类型近年来所占比例不断增加。由于中医在疾病诊断方面的复杂和多样性，使得早期多数实验研究以临床药物的疗效为切入点，例如三七和丹红注射液等^[6-7]。近年来随着系统生物学的发展，人们发现中医理论体系的整体观与现代的系统生物学从基因、细胞、个体组织相结合的研究方法类似^[8-10]，但研究因素较为单一。本研究采取了多中心、小样本、精细化的临床研究，严格筛选病例并且设置健康和疾病对照组对痰瘀互结证进行研究。7家临床单位配合，检测28项涉及7类的临床生化指标，并检测代谢组学和基因组学，以此方法对痰瘀互结证的生物学进行探讨。

2 研究方法 2.1 参与者与研究单位 2.1.1 样本含量的估计

按照前瞻性临床研究样本含量估算公式：

其中p=（p₁+p₂）/2，q₁=1-p，p₁、p₂分别为冠心病痰瘀互结证与冠心病气阴两虚证的患病率，按α=0.05，β=0.10、对应的u_α、u_β可查u值表，u_α=1.644 9，u_β=1.281 6，控制失访率在20%以内。根据既往临床试验数据、经验估算样本量，初步确定前瞻性临床研究样本量120例，包括冠心病痰瘀互结证40例，冠心病气阴两虚证40例，健康人40例，每组男性例数不少于50%。

2.1.2 临床单位分布与病例数

本研究根据中国地域特点与不同地域的人群特征，形成的冠心病研究医疗单位协作网。共包括7家临床单位，各临床研究单位名称及承担的病例数见表 1。

2.2 纳入与排除标准 2.2.1 西医诊断标准

冠心病稳定性心绞痛诊断标准：参照美国心脏病学会和心脏协会（ACC/AHA）制定的有关冠心病心绞痛诊断指南，参考《2007年中国慢性稳定性心绞痛诊断与治疗指南》^[11]制定冠心病及其临床类型的诊断标准。符合以下任何一项或多项即可诊断：1）有明确的陈旧性心肌梗死病史。2）曾行冠状动脉造影或冠状动脉电子计算机断层扫描造影（CTA）检查提示冠状动脉至少一支主要分支管腔直径狭窄≥50%。3）曾接受冠状动脉血运重建[冠状动脉介入术（PCI）或冠状动脉旁路移植术（CABG）]治疗。

排除诊断：冠心病不稳定性心绞痛的诊断参照2007年中华医学会心血管病学分会、中华心血管病杂志编辑委员会《不稳定性心绞痛和非ST段抬高心肌梗死诊断与治疗指南》，包括如下亚型：1）静息性心绞痛：心绞痛发作在休息时，并且持续时间通常在20 min以上。2）初发心绞痛：1个月内新发心绞痛，可表现为自发性发作与劳力性发作并存，疼痛分级在Ⅲ级以上。3）恶化劳力型心绞痛：既往有心绞痛病史，近1个月内心绞痛恶化加重，发作次数频繁、时间延长或痛阈降低（心绞痛分级至少增加Ⅰ级，或至少达到Ⅲ级）。4）变异性心绞痛：通常是自发性。其特点是一过性ST段抬高, 多数自行缓解, 不演变为心肌梗死，但少数可演变成心肌梗死。动脉硬化斑块导致局部内皮功能紊乱和冠状动脉痉挛是其发病原因，硝酸甘油和钙离子拮抗剂可以使其缓解。

2.2.2 冠心病痰瘀互结证患者纳入标准

冠心病痰瘀互结证的诊断标准参考《中药新药临床研究指导原则》和2014年PCI术后胸痛中医诊疗专家共识修订：1）症状：胸闷/胸痛。2）舌象：舌质紫暗（黯），舌有瘀斑瘀点、舌下脉络青紫，苔腻。3）脉象：脉弦滑。（以上3项同时具备，确立诊断。必要时参考表 2冠心病痰瘀互结证辨证标准。）

2.2.3 冠心病气阴两虚证患者纳入标准

冠心病气阴两虚证的诊断标准参考《中药新药临床研究指导原则》和2014年PCI术后胸痛中医诊疗专家共识修订：1）主症：胸闷隐痛，时作时止。2）次症：心悸气短，倦怠懒言，口燥咽干，易出汗，头晕，失眠多梦。3）舌淡红，胖大边有齿痕，少苔或无苔，脉细数或细缓。

2.2.4 健康人纳入标准

健康人年龄为35岁≤年龄≤65岁，参照课题组既往研究建立的健康人标准，排除躯体性疾病包括：排除已经明确被诊断患有各种疾病（按照ICD-10）的居民；物理检查，如测血压、身高、体质量、观察步态、外型；询问既往病史、家族史、女性经带胎产史；医院体检排查（排除已患病但居民自己尚未发现），利用心肺听诊、查体、心电图、X-线片（胸、腹、颈椎等）、B超（肝胆脾肾）、实验室血液生化检查等（血糖、血脂、肝功能、肝炎标志物）、必要行CT、冠状动脉造影；女性妇科专项检查。

2.2.5 病例排除标准

对于以下患者予以排除：1）3个月内发生过心肌梗死或不稳定性心绞痛史、或进行过冠状动脉血运重建术（外科搭桥手术或血管成形术）。2）合并其他心脏疾病、神经官能症、更年期综合征、甲状腺功能亢进、脊髓型或椎动脉型颈椎病、胃-食管返流病或食道裂孔疝等可能引起胸痛的疾病。3）使用β受体阻滞剂、钙离子通道阻滞剂、能量代谢药物、硝酸酯类药物此4类药物超过3种者。4）合并高血压病并经降压药物治疗后血压仍偏高者（收缩压≥160 mmHg，舒张压≥100 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa），重度心肺功能不全，重度心律失常（快速心房纤颤、心房扑动、阵发性室性心动过速等）。5）合并活动性肝脏疾病，或伴有原因不明的血清转氨酶持续升高，或丙氨酸转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）＞2倍正常参考值上限者。6）肾功能异常者。7）合并造血系统或恶性肿瘤等严重原发性疾病者。8）孕妇、哺乳期妇女或有生育要求的育龄妇女。9）精神病患者，或认知功能障碍。10）患有糖尿病肾病、痛风性肾病等严重代谢性疾病者。11）预计依从性差，不能定期访视的患者。12）最近3个月内参加过其他临床试验者。13）研究者认为存在不适合参加该试验的其他情况。

2.3 干预措施

冠心病患者研究期间可维持入组前原方案治疗，入组导入期为2周，使患者病情稳定，符合入组标准。疗程8周，第12周随访1次。

西医常规治疗参照“2007年中国慢性稳定性心绞痛诊断与治疗指南”，包括吸氧、休息、β受体阻滞剂、钙离子通道阻滞剂、能量代谢药物、硝酸酯类药物等。冠心病痰瘀互结证组给予西医常规治疗，加用丹蒌片（生产厂家：吉林康乃尔药业有限公司，批号：20150112，规格：每片0.3 g），5片/次，每日3次，疗程8周。冠心病气阴两虚证组给予西医常规治疗，加用通脉养心丸（生产厂家：天津中新药业集团股份有限公司，规格：每10丸1 g，批号：B107915），40丸/次，每日2次，疗程8周。健康人对照组不予药物干预。

2.4 合并用药规定

患者入组前正在服用治疗冠心病的阿司匹林、他汀类等6类药物者，研究期间可维持入组前方案治疗，使用β受体阻滞剂、钙离子通道拮抗剂、能量代谢药物、硝酸酯类药物此4类药物不允许超过3种。除此之外，禁止加用除研究用药外的其他任何对冠心病有治疗作用的中、西药物。

2.5 采集信息与检测内容 2.5.1 冠心病痰瘀互结证量表学评价

使用冠心病痰瘀互结证病例报告表（CRF）、冠心病痰瘀互结证中医证候评价量表、西雅图心绞痛量表（SAQ）、症状自评量表（SCL-90）、生存质量量表（SF-36）对受试者进行评价，检测时点为第0、4、8、12周。

2.5.2 冠心病相关指标检测

人口学资料包括患者性别、年龄、民族、职业、血压（BP）、心电图等。

检测的生化指标共7类28项，包括：1）内皮损伤指标：血管紧张素Ⅰ（ANG-Ⅰ）等。2）脂质代谢指标：总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）等。3）黏附分子指标：E选择素（E-selection）等。4）金属蛋白酶：金属蛋白酶9（MMP9）、金属蛋白酶2（MMP2）。5）同型半胱氨酸（Hcy）。6）炎症介质指标：肿瘤坏死因子（TNF－α）、核转录因子（NF-κb）等。7）凝血功能指标：凝血酶时间（TT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）等。

以上指标由天津金域医学检验所有限公司集中进行检测。

2.5.3 基因组学检测

在上述样本中选取冠心病痰瘀互结证（8例），冠心病气阴两虚证（8例），健康人（8例）进行表达谱芯片检测，冠心病痰瘀互结组、冠心病气阴两虚组的检测时点为第0、8周，健康人的检测时点为第0周。

2.5.4 代谢组学检测

分别收集各组受试者清晨空腹血样和尿样，－80 ℃保存备用。冠心病痰瘀互结组、冠心病气阴两虚组检测时点为第0、8周，健康人检测时点为第0周，进行代谢组学研究。

2.5.5 指标检测注意事项

1）制定严格的纳入和排除标准，选择依从性较好的患者，保证按时用药，代谢组学检查注意避免代谢性疾病的干扰。2）测定临床生化指标前禁食12 h，并且24 h内不应进行剧烈体育运动。3）样品收集以1个月为期限，每个月集中运输收集的样品，生物样品需保存在-80 ℃冰箱，理论上在6个月之内分析完所有样品检测工作。

2.6 质量控制及依从性估算

为了保证研究的顺利进行，临床试验正式启动前课题组要召开专门的临床培训会，对各中心临床研究者进行统一培训，以提高研究人员的内部观察一致性和观察者之间一致性，保证临床研究结论的可靠性。签署研究者声明，在各参研医院实验室建立各项指标观测和质量控制标准操作规程（SOP）。研究过程中对各中心进行定期监查，控制中心间偏倚。

患者依从性采用服药量计数法，借以测估受试者的依从性，以受试者已服药量80%以上（含80%）作为判别标准，其计算公式如下：

2.7 观察中止标准

观察中止标准：1）由课题组专门成立的数据安全监察委员会（DSMB），全权负责安全性和中期疗效评估，根据其对严重不良事件的监测，判断是否终止整个临床试验。2）每个中心一名心内科医生负责评估研究中出现的严重不良反应，确定是否继续或中止研究。3）研究期间受试者出现严重并发症或其他严重疾病，需采取紧急措施者。4）受试患者撤回知情同意。

2.8 数据管理

本项目采用纸板CRF，所有CRF经过研究者审核并签名批准后生效。所有的CRF和CRF修改痕迹均保留。制定CRF数据核查表，采用有专业背景的双人背靠背方式对纸板CRF数据进行核查。若出现双人核查结果不一致的情况，由第三人再进行核查，选择核查结果出现一致的为准。

采用Epidata3.1建立数据库，由培训合格的两名专业人员根据录入指南进行双人双录入，在录入后对录入的数据逐一核查。当数据核查中所有疑问均已经解决，数据库已更新，且数据核查未发现新的疑问时，数据库将予以锁定。数据库锁定后，任何数据的改动，都需经项目负责人批准并由数据管理单位备案。

2.9 统计分析

由统计学专家经反复论证制定统一的统计分析方案，交予两家统计机构进行背靠背统计分析。对于统计结果不一致的情况，进行讨论确定最终结果。统计分析先进行病例剔除、脱落情况分析，检查各家中心完成例数、剔除和脱落情况；然后进行患者人口统计学及基线值的同质性分析，有效性分析主要包括主次要疗效指标的比较等；安全性分析包括实验室指标异常情况和不良反应发生率的比较。

对定量数据，以均数、标准差、例数、最小值和最大值，或加用中位数、上四分位数、下四分位数、95%可信区间做描述性统计分析。组间或组内治疗前后对比分析，先对变量分布进行正态检验。服从正态分布时，用t检验或自身t检验；非正态分布，用非参数统计方法。对定性数据，以频数表、百分率或构成比做描述性统计分析。组间或组内治疗前后对比分析，用χ²检验、Fisher精确概率法、Wilcoxon秩和检验或Wilcoxon符号秩和检验；两分类指标及等级指标的比较若考虑到中心或其他因素的影响，采用分层χ²检验。一般统计检验均采用双侧检验，P﹤0.05者被认为差异有统计学意义。

2.10 安全性评价与伦理学原则

本课题已通过天津中医药大学伦理委员会的伦理审查，伦理审查批件号TJUTCM-EC20150001，并于2015-11-20注册于美国临床试验注册中心，注册号NCT02526381, 于2015-7-16注册于中国临床试验注册中心，注册号ChiCTR-OOC-15006765。

受试者为来源于7个中心的自愿受试者，均独立签署知情同意书，并放入CRF插页中。医生将定期进行心电图、肝功能、肾功能等检查，密切观察药物可能产生的不良反应，必要时停止试验。如果在研究期间受试者出现任何不适，或病情发生新的变化，或任何意外情况，不管是否与研究有关，均应及时通知医生，医师将对此作出判断并给与适当的医疗处理。

3 讨论

近年来，随着经济发展和人民生活水平的提高，痰瘀互结证已经成为冠心病主要证型之一。本课题依托国家973计划，研究方案前期经副高职称以上专家数10次的反复论证修改，虽不是随机对照试验，但是一项多中心、小样本、精细化的临床研究。本方案较普通的临床对照试验方案设计上有如下几点优势：1）小样本、精细化：本研究对纳入的每组40例患者进行精细化研究，通过临床量表、生化指标、基因组学、代谢组学等多方向多手段，全面探讨冠心病痰瘀互结证的病证方关系。2）多中心的选择：由于中国地域辽阔，海拔、温度及人民生活方式差异也较大，故本研究选取了华东、华北、华中、南部、西部的7家临床单位进行病例收集，充分考虑到了地域间的差异性，将本临床观察地区及患者体质差异的影响降低到较小的范围。3）合并用药的规定：由于冠心病患者多合并高血压、高脂血症等其他疾病，或经PCI手术治疗，需长期服用降血压、抗血小板凝集等药物，本研究对合并用药情况进行了严格规定，体现了设计的严谨性。4）数据统计结果的处理：考虑到统计方法与临床结果的复杂性，本研究经过统计专家反复论证后制定统一的统计计划书。采用两家统计机构对数据进行背靠背统计分析，并对两家机构统计结果出现结果不一致的情况进行研究讨论，确定最终结果，以保证统计结果的准确与科学性。5）临床研究的质量控制：由于临床单位不同，为防止收集样本过程中出现的差异，课题组派出经统一培训的监察稽查人员，对临床单位进行非现场与现场的监察稽查工作，保证收集病例的严谨性。CRF的填写也在培训后进行，并有专业人员进行现场监督核查，后期课题组统一对数据进行二轮核查，确保原始数据的准确。6）统一的样本采集与检测：采集的血液与尿液样本统一规格，请中国最早进入生物医药检测领域的金域检测集团进行统一运输、统一管理。生化指标、液态芯片、表达谱芯片均选择金域检测集团进行检测，保证检测流程统一。

由于临床研究的复杂性，入组个体情况差异与前期治疗情况差异较大，虽研究方案对可能出现的问题都进行了严格的规定，但仍可能影响部分研究结果。后期会根据实际研究情况进一步完善本类研究的临床方案。本方案全面诠释了冠心病痰瘀互结证临床生物学基础研究过程，为冠心病中医证候学研究方案的设计提供参考范例，也为后续相关研究奠定了基础。