芪术两活汤（QZLHD）系清代陈士铎《辨证录》卷三遍身骨痛门首载，主要用于治疗痛风之证，“然痛风之症，多感于风湿，而风湿之感，多入于骨髓”，“以骨髓属肾，肾可补而不可泻”，“泻胃与大肠之风湿，而肾之风湿自去”。该方对痛风的治疗辨证明确，但其现代医学理论依据尚未得以确定。关节的红肿、热痛是痛风性关节炎最常见临床表现，故抗炎镇痛作用是评价药物治疗痛风性关节炎疗效的重要指标。前期实验表明QZLHD水提液对痛风性关节炎大鼠具有抗炎作用，本实验观察QZLHD水提液乙酸乙酯部位及乙醇部位在痛风性关节炎大鼠模型上的药效，以探讨QZLHD对痛风性关节炎的治疗效果及有效成分群，以期为临床应用此方提供实验依据。

1 材料 1.1 实验动物

清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠，8~10周龄，体质量（290±10）g（购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2014-0004，置于本实验室饲养房内饲养1周后用于实验。室温（20±2）℃，湿度50%±5%。每日清洁一次底垫，期间自由进食普通鼠饲料，饮用自来水。

1.2 药品与试剂

人参（批号：201512），肉桂（批号：201508），白术（批号：201512），黄芪（批号：201506），茯苓（批号：201501），甘草（批号：201512），羌活（批号：201508），独活（批号：201511）均购于国药乐仁堂医药有限公司张家口市分公司，阿司匹林片（批号：20151222，重庆迪康长江制药有限公司），尿酸钠（美国sigma公司，批号：U2875-5G）；白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附反应（ELISA）试剂盒（武汉默沙克生物科技有限公司）；尿酸试剂盒（北京柏定生物工程有限公司，批号：000020161）；苏木素伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝生物有限公司，批号：20150622）。

1.3 仪器

1510型全波长酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司），万分之一Sartorius精密电子天平（德国赛多利斯天平公司），TL4型偏振光高倍显微镜（日本OLYMPUS公司），KDC-2044型低速冷冻离心机（科大创新股份有限公司），BL-2000医学图像分析系统（成都泰盟软件有限公司）。

2 方法 2.1 QZLHD的提取及供试液的制备

将药材于60℃干燥2 h后，按照QZLHD处方的比例（人参:肉桂:白术:黄芪:茯苓:甘草:羌活:独活=9:9:30:30:15:3:1.5:1.5），称取QZLHD药材20 kg，加5倍量的蒸馏水回流提取40 min，过滤后，滤渣加3倍量的蒸馏水，继续回流提取30 min，过滤后，合并两次滤液，浓缩为膏状，质量为3.2 kg。依次用乙酸乙酯、75%乙醇提取，每次1 000 mL，各提取3次，浓缩后，得乙酸乙酯部位50 g、乙醇部位500 g。分别加水适量制成混悬液，溶解时加入适量Tween 80助溶，制备各药用部位浓度分别为：2.5和25 mg/mL的供试液，浓度均约相当于1 g药材/mL^[1]。

2.2 实验分组及给药

取清洁级雄性SD大鼠90只，随机分为9组，每组10只，即正常组、模型组、阿司匹林组（270 mg/kg）、QZLHD水提液乙酸乙酯部位低、中、高剂量组（15、25、50 mg/kg）及QZLHD水提液乙醇部位低、中、高剂量组（150、250、500 mg/kg）。造模5 h后灌胃给药，连续给药7 d，模型组和正常组给予等体积生理盐水。

2.3 大鼠痛风性关节炎模型的制备

参照文献[3]方法制备大鼠痛风性关节炎模型。大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥钠10 mL/kg麻醉，左侧后足踝关节背侧常规消毒后，将注射针与胫骨成45°方向刺入踝关节腔，注入均匀混合的浓度为30 g/L尿酸钠混悬液0.1 mL，正常组踝关节腔中注射0.1 mL生理盐水。

2.4 指标测定 2.4.1 关节肿胀度测定

于造模后5 h、24 h、3 d、5 d、7 d，采用缚线法测定大鼠右后踝关节同一部位的周径，按以下公式计算肿胀度^[3]。

肿胀度＝（致炎后踝关节周径-致炎前踝关节周径）/致炎前踝关节周径

2.4.2 大鼠血清中尿酸（UA）的含量测定

末次给药3 h后将大鼠用0.3%戊巴比妥钠10 mL/kg腹腔注射麻醉后腹主动脉取血，室温放置2 h，3 500 r/min离心10 min，留取血清，按尿酸试剂盒说明书测定血清中尿酸含量。

2.4.3 大鼠血清IL-1β、TNF-α含量的检测

取2.4.2项下制备的血清，按照ELISA试剂盒说明书操作检测并计算IL-1β、TNF-α浓度^[4-5]。

2.4.4 大鼠关节组织病理形态学观察及单位面积炎症细胞计数

大鼠取血后，取关节组织，10%甲醛固定30 h，8%硝酸溶液中脱钙48 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后，常规切片，厚度3 μm，HE染色。于400倍光镜下观察关节软组织病理形态学改变^[6-7]；选取炎症细胞最密集区域，观察关节软组织及关节腔内炎症细胞聚集情况，计数单个镜下视野内淋巴细胞数。

2.5 统计方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学处理，实验数据用平均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较若方差齐采用LSD检验，若方差不齐采用Dunnett’s T3检验，P < 0.05时认为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 关节肿胀度测定

与正常组大鼠比较，造模后5 h、24 h、3 d、5 d、7 d模型组大鼠的关节肿胀均显著增加（P＜0.01），24 h肿胀最为明显，出现明显的造模关节局部皮肤发红、皮温升高、运动障碍等致炎症状，关节肿胀度在达高峰后下降。与模型组比较，各治疗组在5 h时，关节肿胀均无显著差异。24 h后，阿司匹林组各时间点关节肿胀均显著减轻（P＜0.01）；QZLHD水提液乙醇部位组均能显著降低肿胀度（P＜0.01），且具有剂量依赖性；其余各组与模型组比较差异均无显著性（P＞0.05）。见表 1。

3.2 大鼠血清中UA的含量测定

与正常组比较，模型组UA水平显著增高（P＜0.01）。与模型组比较，阿司匹林组和QZLHD水提液乙醇部位低、中、高剂量组能显著降低血清中UA水平（P＜0.01），乙酸乙酯部位组与模型组比较差异均无显著性（P＞0.05）。见表 2。

3.3 大鼠血清IL-1β、TNF-α表达的检测

模型组大鼠血清IL-1β及TNF-α浓度均显著高于正常组（P＜0.05）；乙醇低、中、高剂量组及阿司匹林组大鼠血清IL-1β及TNF-α浓度显著低于模型组（P＜0.05），乙酸乙酯部位组与模型组比较差异无显著性（P＞0.05）。见表 2。

3.4 大鼠关节组织病理形态学改变及单位面积炎症细胞计数

正常组大鼠的踝关节滑膜组织结构清晰，无炎细胞浸润。模型组滑膜组织内见有尿酸盐结晶体，炎症明显，炎细胞浸润，滑膜细胞排列不整齐，纤维炎性蛋白渗出物。与模型组比较，阿司匹林组滑膜组织有轻度炎性渗出，滑膜细胞增生，但细胞排列较整齐，结构较完整。QZLHD水提液乙醇部位低剂量组滑膜组织有水肿，表面有炎性渗出，细胞边缘不规整；中剂量组滑膜组织炎性渗出明显减轻，有水肿，无炎细胞浸润，细胞边缘整齐，形态较规则；高剂量组滑膜组织有水肿，炎细胞浸润，但渗出减轻；QZLHD水提液乙酸乙酯部位高、中、低剂量组滑膜组织内病理形态与模型组相似，可见有尿酸盐结晶体，炎症明显，炎细胞浸润，滑膜细胞排列不整齐，纤维炎性蛋白渗出物。见图 1。模型组及QZLHD水提液乙酸乙酯部位组淋巴细胞计数显著高于正常组（P＜0.01），阿司匹林组和QZLHD水提液乙醇部位低、中、高剂量组均显著低于模型组（P＜0.01），结果见表 2。

4 讨论

痛风是长期嘌呤代谢紊乱和尿酸排泄减少引起的一组疾病。高尿酸血症和尿酸盐结晶沉淀是其重要临床特征，同时，血尿酸的测定也是痛风的临床诊断项目之一^[8]。本研究表明，QZLHD水提液乙醇低、中、高剂量组大鼠血尿酸水平显著低于模型组，并且能显著降低关节肿胀度，改变大鼠关节组织病理形态，可有效控制痛风性关节炎的症状。

血清IL-1β是目前公认的最重要的炎症细胞因子之一，大量IL-1β聚集有确切的致炎作用^[9]。在关节部，IL-1β可刺激TNF-α等细胞因子的分泌^[10]，因此，TNF-α也与痛风性关节炎有密切的关系。本实验结果表明，QZLHD水提液乙醇部位低、中、高剂量组及阿司匹林组大鼠血清IL-1β及TNF-α浓度显著低于模型组，提示，QZLHD对痛风性关节炎的治疗作用与抑制IL-1β及TNF-α表达有关。

研究表明QZLHD水提液乙醇部位能显著抑制痛风性关节炎模型大鼠踝关节肿胀度，显著降低模型大鼠血清中UA水平，并能改善滑膜组织病理状态。而QZLHD水提液乙酸乙酯部位均未见改善作用，提示QZLHD治疗痛风性关节炎的有效部位是乙醇提取物。说明QZLHD治疗痛风性关节炎是极性较高的成分，如：人参皂苷、肉桂酸、黄酮苷等共同作用的结果，乙酸乙酯部位中的主要成分为黄酮苷元、香豆素等，结果未发现QZLHD乙酸乙酯部位具有治疗急性痛风性关节炎的作用。此结论提示对QZLHD的进一步开发利用应针对乙醇部位，即高极性化学成分进行深入研究，以确定其确切物质基础。