溃疡性结肠炎（UC）是一种临床较为常见的慢性非特异性炎性肠病，常反复发作、迁延不愈。病变部位主要在乙状结肠、直肠的黏膜和黏膜下层，临床表现为腹痛、腹泻、脓血便等。UC病因不明，其发病与遗传、免疫、环境、感染等多种因素有关，但目前公认免疫因素在UC的发生发展过程中扮演了至关重要的角色^[1]。

调节T细胞（Treg）属于CD4⁺T细胞亚群，能抑制炎症反应，防止过度免疫所致的组织损伤来维持机体的免疫稳态^[2]。Treg与多种自身免疫疾病密切相关，在UC患者肠道黏膜组织也见Treg细胞增多^[3]。Treg能抑制细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、自然杀伤细胞（NK）、CD8⁺T等免疫细胞对靶细胞的杀伤作用，而穿孔素-颗粒酶B途径是上述免疫细胞杀伤靶细胞的途径之一^[4]。免疫细胞识别靶细胞后分泌穿孔素和颗粒酶B，穿孔素附着于靶细胞表面，破坏细胞膜；颗粒酶B则经损伤的细胞膜进入细胞内部，降解DNA进而介导靶细胞凋亡。但穿孔素和颗粒酶B是否与UC发病相关，Treg是否通过调控穿孔素和颗粒酶B的水平发挥减轻UC炎症损伤的作用，目前尚缺乏相关证据。

本院采用健脾利湿汤治疗大肠湿热和脾虚湿蕴型轻中度UC，取得良好效果。本研究拟深入探讨健脾利湿汤的临床疗效，并从细胞免疫角度揭示其治疗UC的机制，为促进中药疗法进一步推广应用提供依据。

1 材料与方法 1.1 实验材料

总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时定量聚合酶链式反应（qPCR）试剂盒均为北京康为世纪有限公司生产。ELISA试剂盒为德国IBL公司生产。所用仪器为ABI 7500型荧光定量PCR仪、Bio-Tek酶标仪等。

1.2 临床资料 1.2.1 诊断标准

西医诊断标准：参考2012年中华医学会消化病学分会（广州会议）制定的《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见》^[5]。

疾病严重程度判断标准：采用改良的Truelove和Witts疾病严重程度分型标准^[6]。

中医证型诊断标准：参照2009年中华中医药学会脾胃病分会《溃疡性结肠炎中医诊疗共识意见》中大肠湿热证和脾虚湿蕴证的表现^[7]。

1.2.2 纳入标准

1）年龄18~65岁，性别不限。2）符合上述诊断标准。3）病情严重程度为轻中度。4）临床类型为初发型或慢性复发型。5）自愿接受本治疗方案并签署知情同意书。

1.2.3 排除标准

1）重度UC患者。2）临床类型为慢性持续型和暴发型的患者。3）克罗恩氏病、阿米巴肠病、细菌性痢疾、肠结核等感染性结肠炎、缺血性肠炎、放射性肠炎的患者。4）合并肠穿孔、肠梗阻大出血等的患者。5）合并心脑肝肾等基础疾病、免疫性疾病、恶性肿瘤及精神疾病等的患者。6）妊娠期或哺乳期妇女。

1.2.4 剔除标准

1）依从性差者。2）服用治疗以外其他药物影响疗效判断者。3）突发其他疾病必须终止治疗者。4）中途退出或失访者。

1.3 患者资料

符合纳入标准的59例患者均来自天津中医药大学第一附属医院脾胃科门诊和病房，其中男23例，女36例，年龄23~65岁，平均年龄45.17岁。临床类型属于初发型的12例，属于慢性复发型的47例。病情严重程度属于轻度的25例，属于中度的34例。

1.4 研究方法

采用随机序列软件分为对照组30例，健脾利湿组29例。

对照组口服美沙拉嗪肠溶片，急性期每日4次，每次1 g；维持治疗每日3次，每次0.5 g。健脾利湿组口服本院自拟的健脾利湿汤（黄连10 g，苦参15 g，败酱草30 g，白头翁15 g，土茯苓30 g，当归15 g，姜黄15 g，党参20 g，炒白术20 g，制附子10 g，防风10 g，厚朴15 g，车前子20 g），每日1剂，水煎服。两组患者每晚均行锡类散灌肠。治疗均持续3个月。

在治疗前、用药后30 d和用药后3个月对患者的主要症状评分、疗效等进行评价；于治疗前和用药后3个月两时间点采集患者静脉血；并采集10例年龄、性别匹配的正常体检外周血，作为正常对照，以评价用药前后患者外周血相关指标的变化。

1.5 疗效评定标准

疗效评定标准参照2009年中华中医药学会脾胃病分会《溃疡性结肠炎中医诊疗共识意见》和《中药新药临床研究指导原则（试行）》制定^[6-7]。

1.5.1 主要症状评分

主要症状指腹痛、腹泻、脓血便。腹泻：正常（0分），无腹泻；轻度（3分），腹泻每日＜4次；中度（6分），腹泻每日4~6次；重度（9分），腹泻每日＞6次。脓血便：正常（0分），无脓血便；轻度（3分），少量脓血；中度（6分），脓血便为主；重度（9分），全部脓血便或便新鲜血。腹痛：正常（0分），无腹痛；轻度（3分），腹痛轻微，隐痛，偶发；中度（6分），腹痛或胀痛，每日发作数次；重度（9分），腹部剧痛或绞痛，反复发作。

1.5.2 证候疗效评价标准

按尼莫地平法计算公式计算^[7]，疗效指数=[（治疗前积分-治疗后积分）÷治疗积分]×100%。

1.5.3 生活质量评价

采用炎症性肠病问卷（IBDQ）评价患者治疗前后胃肠症状、全身症状、情感能力和社会能力评分。该量表共有32个条目。每个问题进行7级评分，总分32~224分，分数越高，代表生活质量越好。

1.6 酶联免疫吸附剂测定（ELISA）法测定细胞因子水平

依照试剂盒说明书，检测血清中促炎因子IL-1β、抗炎因子TGF-β的水平。

1.7 RT-qPCR法测定血中Foxp3、穿孔素和颗粒酶BmRNA的水平

取正常人及患者新鲜血液1.5 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，柱提法提取总RNA，取2 μL总RNA逆转录为cDNA。将cDNA、上下游引物、荧光染料等加入反应体系中，RT-qPCR法检测。引物由苏州金维智公司合成。Foxp3引物序列为5’-CACTGGTTCACACGCATGTTT-3’和5’-CACCCGC-ACAAAGCACTTG-3’；穿孔素引物序列为5'-CGC-CTACCTCAGGCTTATCTC-3'和5'-CCTCGACAGT-CAGGCAGTC-3'；颗粒酶B引物序列为5'-TGGGG-GACCCAGAGATTAAAA-3'和5'-TTTCGTCCATA-GGAGACAATGC-3'；GAPDH引物序列为5′-AGG-GCTGCTTTTAACTCTGGT-3′和5′-CCCCACTTGA-TTTTGGAGGGA-3′。PCR扩增条件为：94 ℃预变性15 min；94 ℃ 15 s、60 ℃（Foxp3）/58 ℃（穿孔素）/59 ℃（颗粒酶B）/58 ℃（GAPDH），均为30 s；72 ℃ 30 s；进行40个循环。反应结束，2^-ΔΔCT法分析结果，计算目的基因相对于管家基因GAPDH的表达情况。

1.8 统计方法

使用SPSS 17.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示；其中主要症状评分采用重复测量数据的双因素方差分析；组内和组间两两比较采用单变量双因素方差分析；患者生活质量、炎症因子水平、基因表达等组内比较采用配对样本t检验；组间比较采用独立样本t检验。计数资料中无序资料采用χ²检验，有序资料采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 患者一般情况

正常人10例，其中男4例，女6例；平均年龄（42.71±3.84）岁。对照组30例患者中，男9例，女21例；平均年龄（44.38±6.53）岁；病情程度，轻度13例，中度17例。健脾利湿组29例患者中，男14例，女15例；平均年龄（45.96±6.83）岁；病情程度，轻度12例，中度17例。对照组和健脾利湿组患者在性别、年龄、病情严重程度等方面无统计学差异，具有可比性（P＞0.05）。所有患者均完成12周的临床试验观察。

2.2 患者治疗前后主要症状评分比较

两组患者治疗前腹痛、腹泻、脓血便等主要症状评分无统计学差异（P＞0.05）。治疗30 d后，两组患者上述症状均较治疗前明显改善（P＜0.05），但两组间比较均无统计学差异（P＞0.05）。治疗3个月后，两组患者上述症状均较治疗前有显著改善（P＜0.05，P＜0.01）；健脾利湿组的改善效果优于对照组（P＜0.05，P＜0.01），见表 1。

2.3 患者治疗前后疗效指数比较

治疗30 d和3个月后，健脾利湿组疗效优于对照组（P＜0.05），见表 2。

2.4 患者治疗前后生活质量比较

治疗3个月后，两组患者在胃肠症状、全身症状、情感能力和社会能力等方面的生活质量均较治疗前明显提高（P＜0.05）；且除社会能力外，健脾利湿组在其他方面的改善情况明显优于对照组（P＜0.05），见表 3。

2.5 患者治疗前后细胞因子的变化

与正常人相比，治疗前两组患者血清中促炎因子IL-1β水平较高，而抗炎因子TGF-β水平较低，差异均具有统计学（P＜0.01）；经过治疗，两组患者血清中上述细胞因子水平向相反方向变化，与本组治疗前相比差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），且健脾利湿组改变更为明显（P＜0.01），见表 4。

2.6 患者治疗前后Foxp3等基因表达的变化

与正常人相比，治疗前两组患者外周血中Foxp3 mRNA表达水平较低，而穿孔素和颗粒酶B mRNA表达水平较高，差异均具有统计学意义（P＜0.01）；经过治疗，两组患者外周血中上述基因表达水平向相反方向变化，与本组治疗前相比差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），且健脾利湿组的改变更为明显（P＜0.05），见表 5。

3 讨论

近年来，UC发病率呈逐年增高态势。其病程迁延反复，易致癌变，因而被WHO列为难治性疾病。UC病因不明，但由于UC患者常伴有外周关节炎、前葡萄膜炎、结节性红斑等自身免疫性疾病；加之免疫抑制剂对UC具有较好的治疗效果，因此免疫因素被认为在UC的发生发展过程中起到了至关重要的作用^[1]。

Treg是一类具有免疫抑制功能的细胞群，通过控制免疫应答的强度，防止过度免疫所致的组织损伤来维持机体的免疫稳态，Foxp3是其特征标志物^[2]。研究显示，与正常值相比，UC患者外周血中Treg数量降低，而肠道黏膜中Treg数量增加；UC患者外周血中Treg数量与疾病活动性呈负相关，UC活动期时外周和肠道黏膜的Treg数量呈一低一高的反方向变化趋势^[1]。循环中Treg数量下降可能是UC发生后的一种适应性反应，机体藉此募集更多的Treg以减轻肠道组织的炎症反应。此外，UC患者肠道黏膜组织中IL-1β、IL-6等促炎因子水平升高，IL-10、TGF-β等抗炎因子水平下降；随病情缓解，可见IL-1β、IL-6水平下降，IL-10、TGF-β水平上升^[8]。Treg通过分泌TGF-β来抑制效应T细胞的活性；TGF-β又可促进T细胞向Treg分化，由此增加肠道组织中Treg数量，减轻UC过强的细胞免疫反应。

穿孔素和颗粒酶B是由CTL、NK、CD8⁺T等免疫细胞分泌的细胞毒性蛋白，两者与细胞免疫功能直接相关，在清除细菌和病毒感染及对肿瘤细胞的免疫监视方面具有重要作用。研究显示，活化后的Treg细胞可表达颗粒酶B，通过穿孔素/颗粒酶B途径杀伤多种自体靶细胞^[1]。但目前穿孔素/颗粒酶B途径与UC发病之间的证据还很少。

西医治疗UC多采用氨基水杨酸类药物（如美沙拉嗪）、糖皮质激素、免疫抑制剂（如硫唑嘌呤等）、生物制剂[如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等]。氨基水杨酸类药物治疗UC有效率高，但易引起恶心、呕吐、白细胞减少等不良反应。糖皮质激素是治疗急性期UC最为有效的药物，抗炎作用强，但不能久用。免疫抑制剂对重度、顽固性UC患者有明显的治疗作用，但其在抑制肠道免疫的同时，也会抑制全身免疫功能，常见不良反应主要有肝肾功能异常、白细胞减少、变态反应、感染等。生物制剂也用于重症患者，起效快、疗效好，但此类药物价格昂贵，长期应用的不良反应尚待观察^[9]。相比于西药，中医药在治疗UC、提供机体免疫功能方面有独特优势。

UC在中医学中，属于“泄泻”、“肠澼”等病范畴。主要是由于脾胃虚弱，运化失权，致使气血生化不足，从而外邪内侵，损伤肠络。此外，脾失健运，胃失和降，导致水反为湿，谷反为滞，聚而为患，从而湿热内生，热毒蕴结于肠，气滞血凝，化为脓血而发病。基于UC脾虚失健、湿热蕴肠的病因病机，本院采用健脾利湿方剂治疗轻中度UC，取得良好疗效。方中黄连、苦参清热解毒燥湿；败酱草、白头翁、土茯苓清热解毒，活血化瘀；当归、姜黄养血活血，通络止痛；党参、白术益气健脾；制附子散寒除湿；温肾暖脾；厚朴、防风、车前子行气化湿。诸药合用，共凑健脾活血清热利湿之功。

本研究结果发现，健脾利湿方剂在改善患者腹痛、腹泻、脓血便症状上明显优于美沙拉嗪；也能更好地促进患者生活质量的改善。此外，本研究还发现UC患者外周促炎因子IL-1β水平较高时，穿孔素和颗粒酶B mRNA表达水平较高；与此同时，抗炎因子TGF-β水平及Foxp3 mRNA水平则较低。经治疗，患者病情缓解的同时，上述指标均向相反方向变化。说明穿孔素/颗粒酶B的水平与机体内炎症反应强度存在一致性，穿孔素/颗粒酶B通路参与了UC病理过程的发生发展。健脾利湿方剂通过调节Treg的数量和功能，增强其免疫抑制功能，抑制穿孔素/颗粒酶B对靶细胞的杀伤作用，以此减轻肠道组织的炎症反应。