过敏性鼻炎（AR）是由于鼻腔黏膜发生变态反应而引起的疾病, 所以又称变应性鼻炎^[1]，AR为耳鼻喉临床科常见病、多发病。近年来，AR的发病率呈现逐年上升的趋势，全球发病率为10%~25%^[2]，中国AR患病率为8.7%~24.1%^[3]。AR在祖国医学中属于“鼻嚏”、“鼻鼽”、“鼽嚏”的范畴。“肺气虚则鼻塞不利”，肺开窍于鼻，鼻有赖于肺气的充养，故肺病可引触鼻病; 肾为先天之本，诸阳之根，主纳气。先天禀赋不足，或后天久病伤肾，肾阳不足，肺失温煦，易感外邪。此情况多出现肺脾肾三脏阳气亏虚，寒水上泛而不能制，尤易受风寒异气之刺激而发病。鼻的正常生理功能的发挥依赖肾的精气充养，如果阳气不足，不能温化水饮，寒湿上泛，则使鼻流清涕，可见肾气不足，肺失温养, 可导致鼻鼽的发生。西医多采用抗生素或激素治疗AR，虽然效果显著，但不能从根本上解决问题；而中医采用整体论治和辨证治疗AR，疗效显著, 并且积累了大量的临床经验, 与西医相比, 有独特的优势，但中医辨证治疗AR存在许多的问题，缺乏科学严谨客观的评价标准, 使得中医辨证治疗AR的临床疗效不能被很好的证实，严重制约了中医临床研究与国际接轨，如何使中医辨证治疗得到客观化、可视化, 已经成为目前中医研究的热点问题。

代谢组学是研究生物体受到刺激或扰动后，所有低分子量的代谢产物随时空变化的一种组学方法^[4]，是一种整体系统的研究技术，在方法学上具有融整体、动态、综合、分析于一体的特点, 与中医学的整体观念和辨证论治思维模式上存在天然的一致性，两者均表现的是致病因素与机体反应共同的结果，为中医证候研究提供了新的思路和方法^[5]。因此，本研究采用气相色谱质谱联用（GC/MS）技术，进行AR患者肺虚感寒证和肾阳亏虚证患者血清代谢组学研究，寻找AR不同中医证候患者的血清中特异性代谢产物的变化，有可能为中医辨证的客观化、定量化开辟一条新途径，对中医证候的规范化、现代化具有重要意义。

1 材料与方法 1.1 一般资料

所有AR患者均来自于2016年10-12月上海市宝山区中西医结合医院针灸门诊患者。本研究患者14例作为肺虚感寒组，其中男8例，女6例，患者平均年龄（44.46±4.94）岁；6例作为肾阳亏虚组，其中男3例，女3例，患者平均年龄（47.55±5.14）岁；20例健康人作为对照组，其中男10例，女10例，平均年龄（46.12±5.63）岁，3组性别、年龄等基本资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 诊断标准 1.2.1 西医诊断标准

参照2009年中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会组制定的《变应性鼻炎诊断和治疗指南》推荐的标准^[6]。

1.2.2 中医辨证标准

参照1994年国家中医药管理局发布的《中医病证诊断疗效标准》^[7]中的肺虚感寒证和肾阳亏虚证辨证标准。

1.2.3 纳入标准

年龄18~65岁之间的门诊或住院患者；性别不限；凡符合西医AR诊断标准及中医肺虚感寒证和肾阳亏虚证辨证标准, 签署知情同意书者。

1.2.4 排除标准

合并有严重的肝肾功能不全、心脏病、脑血管病、糖尿病等；其他过敏性疾病患者。

1.3 研究方法 1.3.1 血清采集

叮嘱研究对象在样本收集前3 d清淡饮食，避免食用海鲜以及辛辣食物，以减少食物对代谢造成的波动。研究对象集中到门诊，由工作人员抽取早晨空腹的血液5 mL，置于离心管中密封，记录标号，-4 ℃冰箱静置1 h，然后离心，吸取上清液，于-80 ℃冰箱冷冻保存，待检测。

1.3.2 试剂与仪器

BSTFA+1%TMCS，双三甲硅基三氟乙酰胺[N，O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide]，购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，批号: B0830；盐酸甲氧胺（methoxyamine hydrochloride），购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，批号：M0343；2-氯苯丙氨酸、十七碳酸、吡啶、甲醇皆为分析纯，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

气相色谱/质谱联用仪（7890A/5975C，安捷伦科技有限公司）；气相毛细管色谱柱（HP-5MS，5%苯/95%甲基聚硅氧烷30 m×250 μmi.d., 0.25 μm film thickness, Agilent J & W Scientific, Folsom, CA, USA）；冷冻离心机（H1650-W，Eppendorf）；混匀仪（QL-866，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；鼓风干燥箱（DHG-9240，YiHeng）；真空离心浓缩仪（Eppendorf 53050）。

1.3.3 血清样品前处理

实验前2 h，将所有样本在4 ℃下融化；取样本100 μL于1.5 mL离心管中, 加入400 μL甲醇，振荡60 s，充分混匀；加入60 μL十七碳酸（0.2 mg/mL）作为内标，涡旋振荡60 s；在12 000 r/min 4 ℃离心10 min，取全部上清液转移到新的1.5 mL离心管中，样品用真空离心浓缩仪浓缩至干；加入60 μL盐酸甲氧胺溶液涡旋振荡30 s，在37 ℃条件下反应2 h；最后加入60 μL BSTFA试剂（双三甲硅基三氟乙酰胺，含1%三甲基氯硅烷，37 ℃条件下反应90 min，12 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清液加入到检测瓶中。

1.3.4 GC/MS分析条件

色谱及质谱参数如下：系统载气及流速：进样量1 μL，分流比20:1，氦气1 mL/min，进样口温度280 ℃；离子源温度230 ℃；接口温度150 ℃；升温程序以60 ℃为初始温度，持续2 min，以10 ℃/min的速率上升到300 ℃并在300 ℃停留5 min，溶剂延时5 min；电离方式EI；电子能量70 eV；质谱扫描范围：m/z35-780；全扫描方式。

1.3.5 数据处理与模式识别方法

原始GC/MS数据文件，通过Agilent MSD ChemStation工作站转换成NetCDF格式，然后导入到R3.3的XCMS程序包中进行峰识别、峰过滤、峰对齐等过程，最终得到1个保留时间、质荷比和峰强度组成的三维矩阵表，将三维矩阵导入SIMCA-P11.5软件（Umetrics, Sweden）中进行多维统计分析。采用非监督的主成分分析（PCA）和监督分析法如正交偏最小二乘法（OPLSA）建模，寻找造成样本聚集和离散的主要差异变量。基于差异表达的代谢物鉴定，主要是结合AMDIS程序进行，利用National Instituteof Standards and Technology（NIST）商业数据库和Wiley Registry代谢组数据库及本实验室建立的标准品代谢物谱库。

2 结果 2.1 代谢指纹图谱宏观分析

比较正常对照组、肺虚感寒组和肾阳亏虚组样本的典型血清总离子色谱图，宏观上观察到这3组的代谢指纹图谱有细微的差异，主要是峰强度有一定的差异，结果见图 1。

2.2 代谢谱分析

为了观察所有样本的大致趋势以及样本的自然分布和组别关系，发现聚类和奇异点，首先使用非监督的PCA，分别分析了正常对照组、肺虚感寒组和肾阳亏虚组的血清代谢谱，结果显示，在无监督状态下各组血清代谢物谱不能区分，交叉聚集，结果见图 2。为了进一步筛选AR不同证型分类的关键变量，对各组数据进行了三维的PLS-DA分析，经7次重交叉验证，模型的R2Y=0.71，Q2Y=0.17, 分类结果如图 3所示。

2.3 差异代谢物的分析

基于PLS-DA分析结果，依据权重系数VIP＞1, 相关系数的阈值|r|＞0.4，P＜0.05，测得的差异代谢物，单维上进行验证（t-test检验，P＜0.05），结合AMDIS程序，利用NIST商业数据库和Wiley Registry数据库及本实验室建立的标准品代谢物谱库，鉴定了23个差异代谢物，并进行了相对浓度单维上变化情况的考察，结果见图 4和表 1。

3 讨论

本研究采用基于GC/MS技术的血清代谢组学方法，进行AR患者肺虚感寒证和肾阳亏虚证血清代谢谱研究，PLS-DA方法能够区分AR肺虚感寒证、肾阳亏虚证和正常对照组的代谢谱，而且这2个证型之间也可以区分。经多维和单维统计分析，获得了丙氨酸、十四烷酸、十六烷酸、9，12-十八碳二烯酸、9-（Z）-O-十八碳烯酸、十八烷酸等6个与肺虚感寒证、肾阳亏虚证密切相关的潜在标志物，这些标志物含有特定的生物学内涵。

首先，血清中找到的与氨基酸代谢有关的有统计学差异的标志物是丙氨酸。

丙氨酸在体内经血液运到肝脏，通过联合脱氨基作用生成氨和丙酮酸，丙酮酸经糖异生途径生成葡糖糖，因此，丙氨酸是葡萄糖循环途径中的重要参与者与调控者，其代谢异常与肾小球的滤过和回收功能有关^[8]。本研究中，肺虚感寒证组的丙氨酸含量比肾阳亏虚证组低。说明肺虚感寒证组比肾阳亏虚证组存在更严重的氨基酸代谢紊乱。

本研究还发现十四烷酸、十六烷酸、9，12-十八碳二烯酸、9-（Z）-O-十八碳烯酸、十八烷酸等一些脂肪酸发生了变化。脂肪酸是最基本的脂质成分，主要由脂类物质的分解产生和其他物质的分解转化而成。脂肪酸根据有无双键及其数目，可分为3大类：饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸，不同的脂肪酸可能具有不同的作用，可能有的对机体起保护作用，有的对机体产生危害^[9]。据报道，脂代谢异常导致血中脂肪酸增加，而脂肪酸的升高可以通过溶酶体途径使肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达增加，脂肪酸导致Bax易位于溶酶体，组织蛋白酶从溶酶体易位于胞浆，最后溶酶体破裂，核转录因子-κB（NF-κB）降解，释放出NF-κB，定位到核内，激活TNF-α并且TNF-α、白介素-6（IL-6）与脂肪酸呈正相关^[10-11]。在炎性疾病中TNF-α扮演着重要的角色，特别是AR患者，其鼻黏膜下组织中巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞等数量均相对较多，其均可生成TNF-α，因此，AR的发病与TNF-α有关系^[12]。而IL-6作为细胞因子, 其拥有多功能, 其在炎症反应、免疫应答等方面均扮演着重要的角色。IL-6是通过单核、巨噬细胞等诱导下出现的细胞因子，可直接激活血管内皮细胞与炎性细胞，具有一定的毒性，还可促进急性期蛋白合成，从而进一步增加了炎性反应。IL-6能够调节IgE免疫应答，还可以上调黏附分子的表达，参与多种白细胞黏附与聚集，也可以加强炎症反应^[14]。Omega-3来自深海鱼油，其主要成分是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），DHA和EPA主要是通过PPARα-IκB-NFκB的信号通路影响炎症信号传递。EPA或DHA与PPARs结合后启动抑制蛋白I-κB的基因表达，在细胞质中I-κB与NF-κB结合使后者处于非活性状态，从而抑制NF-κB介导促炎信号的传递^[15]，Omega-3多不饱和脂肪酸能够抑制炎性细胞因子的分泌从而降低病理性炎性反应^[16]，Omega-3能影响脂肪乳剂代谢的中间产物-花生四烯酸的代谢，使其产生前列腺素和系列白三烯产物，从而有助于下调过度的炎症反应，促进巨噬细胞的吞噬功能，改善机体的免疫机制^[17]。以上研究表明，脂肪酸在AR的发病中有很重要的作用, 本研究中，肺虚感寒证组的十四烷酸、十六烷酸、9，12-十八碳二烯酸、9-（Z）-O-十八碳烯酸、十八烷酸含量均比肾阳亏虚证组低，说明肺虚感寒证组比肾阳亏虚证组存在更严重的脂肪酸代谢紊乱。

两种中医证型的共同特点是与氨基酸代谢和脂肪酸代谢异常相关，反映了机体在各因素综合作用下的终端效应, 是各个因素效应的综合体现, 但是两种中医证型之间又有不同的代谢特点，其中丙氨酸、十四烷酸、十六烷酸、9，12-十八碳二烯酸、9-（Z）-O-十八碳烯酸、十八烷酸的相对含量在两种证型间有统计学差异，使得AR两证型在临床鉴别中有了可靠的客观化及量化的依据。由此说明，本试验使用GC/MS的代谢组学方法能够全面反映肺虚感寒证、肾阳亏虚证AR患者的代谢共性和各自特征，代谢组学分析技术可运用于临床不同中医证型的分类研究。