艾滋病（AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（HIV）引起的一种复杂疾病，其治疗一直是医学难题。HIV属于逆转录病毒，变异性强，在使用单靶点药物治疗AIDS的过程中，病毒容易产生耐药^[1]。运用网络药理学对复杂疾病进行网络分析，发现AIDS等复杂疾病由多因素共同作用，其病理过程涉及多个细胞信号分子，仅针对单一细胞信号分子难以起到良好的治疗效果。多靶点药物能够多途径调节疾病的信号通路，同时作用于复杂疾病的多种细胞信号分子，提高治疗效果^[2-3]。目前，临床上采用多药多靶点药物即“鸡尾酒”疗法（HAART）治疗AIDS。但多药联用毒副作用更大，容易引起不良反应，患者的依从性较差^[1]。加之病毒交叉耐药的产生，影响了HAART的治疗效果，新型抗HIV药物的研发依然紧迫。与多药多靶点药物相比，单药多靶点药物为单一化学实体，药代动力学性质更好掌握，并且能够减少交叉耐药的发生。目前，虽然尚未有HIV单药多靶点抑制剂进入临床研究阶段，但单药多靶点药物已成为抗HIV创新药物的重要思路。

天然产物数量巨大，种类繁多，是研发新药和寻找先导化合物的重要来源。目前，在针对AIDS的天然产物研究中，发现了其中不乏对HIV病毒具有抑制作用的化合物。前期，总结了来源于天然产物的HIV单药多靶点抑制剂，这些抑制剂按照结构可以分为黄酮类、三萜及其苷类、苯丙素类、蛋白和肽类等，其中数量较多是黄酮类化合物，包括：蛇葡萄素（Ampelopsin)、灯盏花乙素（Scutellarin）、黄芩素（Baicalein）等^[4]。这些抑制剂大多是针对HIV整合酶（IN）、逆转录酶（RT）和核糖核酸酶H（RNase H），以作用于IN链转移抑制剂(INSTI)作用位点和RT非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)结合部位的双靶点抑制剂[RT（NNRTI）/IN]居多。因此，天然产物对于HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂的开发具有重要意义。

虚拟筛选^[5]是指在计算机上，运用分子模拟技术和CADD方法，寻找与受体具有一定亲和力的小分子化合物，以提升筛选效率，缩短研发周期。选择3-OH HEPT类HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂^[6-7]展开研究，构建针对HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂的分子相似性搜索模型，建立NNRTI和RT以及INSTI和IN对接模型^[8-10]，并基于两种筛选策略分别对TCMD^[11]进行虚拟筛选：策略一，先后利用相似性搜索、利平斯基五规则和分子对接对TCMD逐步筛选，根据分子对接的打分高低排序；策略二，前期研究中基于所建的HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂六点药效团模型和利平斯基五规则对TCMD进行筛选，得到数据库TCMD-SearchMD^[10]，再基于分子对接对TCMD-SearchMD进行筛选，根据打分高低排序。然后，将这两种策略筛选出的小分子化合物进行整理分析，以期从中发现潜在的HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂。

1 材料 1.1 软件

分子模拟与分子设计软件包MOE2009.10^[12]和SYBYL8.1^[13]。

1.2 数据库

TCMD2003.1^[11]，包括9 127个化合物结构及其相关信息；本研究前期对TCMD筛选得到数据库TCMD-SearchMD^[10]，包括229个化合物结构及其相关信息。

1.3 受体结构

从蛋白数据库（PDB）下载1JLA^[14]，为RT与HEPT类NNRTI TNK-651的复合物晶体结构，实验室基于IN与5ClTEP复合物晶体结构1QS4构建的理论模型1QS4（2Mg²⁺）^[15]。

2 方法 2.1 分子相似性搜索模型的构建

本研究分别选择TNK-651^[16]和已知3-OH HEPT类HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂^[6-7]中活性较高的化合物1、2（见表 1）为模板分子，在MOE相似性搜索模块分别设定相似性系数（Tanimoto coefficient）为45%、50%和60%，对TCMD进行筛选，比较不同相似性系数命中的化合物，进而确定模板分子和对应的相似性系数。Molecular fingerprinting计算方法设定为MACCS，Force field为MMFF94x。

2.2 构建分子对接模型 2.2.1 配体准备

分别将配体分子TNK-651和5ClTEP从1JLA和1QS4（2Mg²⁺）中抽提出来，在SYBYL配体结构准备模块（ligand structure preparation）对配体分子进行加氢和能量优化。参数Force field选择Tripos，Method为Powell，Termination为Gardient 0.001 kcal/（mol·Å），Max Iterations为10 000。

2.2.2 受体准备

受体准备在SYBYL Surflex-Dock蛋白结构准备模块(prepare protein structure)完成，首先将1JLA和1QS4（2Mg²⁺）配体分子TNK-651和5ClTEP抽提出来，保留A链，删除结晶水，对氨基酸残基进行加氢。然后，分别以1JLA和1QS4（2Mg²⁺）中配体的坐标为中心生成Protomol即结合口袋，保存结果用于后续研究。

2.2.3 分子对接

为确定RT和NNRTI以及IN和INSTI最佳对接参数，在SYBYL Surflex-Dock模块，将配体分子TNK-651和5ClTEP分别对接回RT和IN活性位点。选择标准模式对接，设定TNK-651的结晶构象和5ClTEP结合构象为参比分子。调整对接参数设置，使配体分子对接构象最大程度重现复合物结构中配体分子原构象。一般以配体分子对接构象与复合物中结晶构象之间的均方根偏差（RMSD）值作为判断标准，当RMSD ≤ 2.0Å时，对接能够较好地重现出原配体分子的空间位置及构象。

2.3 数据库搜索

TCMD库中包含9 127个化合物，为加快筛选速度，提高阳性率，制定两种筛选策略^[17]。策略一：（1）运用构建的分子相似性搜索模型对TCMD进行筛选，设定化合物2为模板化合物，相似性系数为50%。（2）利用利平斯基五规则进行类药性分析。（3）将（2）筛选得到的化合物分别与RT和IN活性口袋对接。策略二：将TCMD-SearchMD中化合物分别与RT和IN活性口袋对接，对接采用筛选模式，参数设置与上文2.2一致。

3 结果 3.1 分子相似性搜索模板分子和相似性系数

在构建分子相似性搜索模型的过程中，分别以TNK-651和化合物1、2为模板分子，选择相似性系数为60%、50%、45%对TCMD进行搜索，结果显示，比较发现当相似性系数为50%时，命中化合物的数量适中，用于下一步分子对接筛选。而化合物2活性较高，且对RT和IN抑制活性更为均衡。综合考虑，本研究选择以化合物2为模板分子，相似性系数为50%的分子相似性搜索结果用于后续研究。见表 2。

3.2 分子对接模型和参数

本研究分别构建NNRTI和RT活性位点以及INSTI和IN活性位点对接模型，通过调整对接参数，使配体和酶达到最合理的相互作用。结果显示，TNK-651与RT对接得分为10.60，对接构象与1JLA中结晶构象空间距离的RMSD值为0.977Å。5ClTEP与IN对接得分为3.98，对接构象与1QS4（2Mg²⁺）中原构象空间距离的RMSD值为1.187Å。可以看出，空间距离的RMSD值均在2Å以下，提示对接构象比较完整地重现了配体分子原构象的空间位置，程序适用，参数设置合理。对接参数设置如下：Max conformations per Fragment为20，Minimum RMSD Between Final Poses为0.05Å，Maximum Number of Poses per Ligand为20。

3.3 筛选结果 3.3.1 基于策略一的筛选结果

本研究将相似性搜索命中的152个化合物利用利平斯基五规则筛选，命中100个小分子。100个小分子中51个与IN对接打分大于4，有43个与RT对接打分大于4，与IN和RT对接打分均大于4的有28个。其中，与IN对接打分大于6的有8个，与RT对接打分大于6的有14个，与IN和RT对接打分均在6以上的有7个。见表 3。

3.3.2 基于策略二的筛选结果

将TCMD-SearchMD中小分子分别与IN和RT进行对接，与IN对接打分在4以上的有158个，与RT对接打分在4以上的有195个，与IN和RT对接打分均大于4的有143个；其中，与IN对接打分在6以上的有47个，与RT对接打分在6以上的有121个，与IN和RT对接打分均大于6的小分子有29个。见表 4。

3.3.3 综合筛选结果和理论验证

综合筛选结果，除去1个相同的生物碱类化合物M7351，得到35个潜在HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂，与RT和IN对接得分均大于6，对抑制剂的结构类型进行总结，包括黄酮类（15个）、生物碱类（8个）、多酚类（3个）、苯丙素类（3个）、苷类（3个）、有机酸类（2个）和醌类（1个），黄酮类化合物占到了42.86%，包括蛇葡萄素、麝香草素、车前子苷等，而策略一对TCMD筛选命中的7个化合物全部为生物碱类。与RT和IN对接结合较好的化合物蛇葡萄素结构如图 1（a）所示，图 1（b，c）为其与RT活性位点相互作用2D、3D示意图，可以看出除疏水相互作用外，蛇葡萄素糖环3-OH与Lys101、Lys103之间形成氢键相互作用，糖环1-位苯环与Tyr188之间形成π-π相互作用。观察蛇葡萄素与IN活性位点相互作用[见图 1（d、e）]，可以看出其与IN之间除存在疏水相互作用和氢键相互作用外，还通过氨基酸残基Asp64和Asp116共同与双Mg²⁺发生金属离子螯合作用。

4 讨论

不同的筛选方法具有各自的针对性和优缺点，每种方法均有可能漏筛。本研究通过两种策略对TCMD进行筛选，每种策略既可以筛选到相同的化合物，也可以筛选到不同的化合物。采用两种策略，能够相互补充，避免漏筛。TCMD库包含9 127个化合物，本研究首先采用相似性搜索和药效团筛选，接着运用利平斯基五规则分析，得到的小分子分别与RT和IN进行对接，最终保留潜在的HIV RT(NNRTI)/IN双靶点抑制剂。已有研究表明，利用Surflex-Dock程序进行分子对接，打分>4时配体与受体之间存在较强的相互作用，打分>6则可以预测配体对受体的抑制活性达微摩尔级。为加快新药发现的速度和减少不必要的浪费，本研究优先选择与RT和IN对接打分均大于6的化合物进行分析，以确定率先展开实验研究的化合物。从数量上看，命中的黄酮类化合物占到了42.86%，是开发潜在HIV RT(NNRTI)/IN双靶点抑制剂的主要来源，与文献报道天然产物中HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂中黄酮类化合物居多一致。

本研究的筛选结果与其他研究者实验研究也有契合点，如实验表明杜仲提取物能够抑制HIV gp41六螺旋结构的形成，是潜在的HIV抑制剂^[18]，本研究筛选得到来源于杜仲的酚类化合物Koaburaside，Koaburaside具有潜在的HIV RT和IN抑制活性，可能是杜仲提取物抗HIV的物质基础。苦参中的黄酮类化合物苦参新醇H（Kushenol H）具有弱抗单纯性疱疹病毒HSV-1和HSV-2活性^[19]，本研究筛选结果显示其与HIV RT和IN对接打分均大于6，预测对RT和IN抑制活性在微摩尔级。此外，化合物蛇葡萄素能抑制HIV的感染，还能干扰HIV对CD4⁺细胞的黏附^[20]，本研究对接结果表明蛇葡萄素与RT和IN结合较好，并与活性位点之间形成了关键相互作用，表明其可能是通过作用于HIV RT和IN，发挥抗HIV活性。

综上，本研究运用分子模拟技术和CADD方法构建了针对TCMD的虚拟筛选模型和策略，检出35个潜在的HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂，为天然产物来源的HIV双靶点药物研发提供了理论基础和发展方向。