癫痫是小儿神经系统的常见病之一，以反复癫痫发作为共同特征的慢性脑部疾病状态。癫痫发作与神经元损伤密切相关。一方面，神经细胞坏死、缺失、结构异常等使脑细胞维持电位稳定的能力下降，一旦有诱发因素则易引发癫痫。另一方面，长期或反复的癫痫活动，可对未成熟大脑的发育、神经元功能、可塑性相关基因表达造成长期不良影响^[1-2]。细胞自噬被称为Ⅱ型程序性细胞死亡，其在癫痫等神经系统疾病中的作用正成为研究的热点。细胞自噬的作用具有双重性，低水平的自噬对细胞具有保护作用，过度的自噬可致神经元损害。Beclin-1是自噬的正调节蛋白，是介导其他自噬蛋白定位于前自噬小体的关键因子。研究表明反复惊厥新生大鼠皮质Beclin-1水平明显上调，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）通过抑制Beclin-1表达，参与自噬途径的调控^[3]。B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）能够减弱Beclin-1与Vps34的相互作用，使其他自噬相关蛋白难以结合到自噬体膜上，从而抑制自噬的发生^[4]。课题组前期研究已证实，以“益肾填精法”为主的茸菖胶囊抗癫痫及改善认知损害疗效显著^[5]，在保护受损神经细胞方面具有明显优势^[6-7]，其机制是否与调控海马神经元自噬过程相关尚未研究。本研究通过构建无镁诱导的癫痫模型，观察茸菖胶囊干预后6、12、24、72 h对海马Beclin-1、Bcl-2蛋白表达的影响，探讨其抗癫痫和神经保护作用的自噬调控机制。

1 实验材料 1.1 实验动物

健康成年大耳白家兔30只，雌雄均可，体质量2~2.5 kg，购自北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司[合格证号：SCXK（京）2015-0005]。24 h内新生SD大鼠50只，购自北京芳元缘养殖场。

1.2 实验药品与试剂

茸菖胶囊（由天津中医药大学第一附属医院提供，批件号：津药制字Z20070735）；3-MA（Sigma公司）。5x SDS凝胶加样缓冲液、显影液、定影液、胰酶细胞消化液等购自碧云天生物技术公司；30%丙烯酰胺Acr/Bic、过硫酸铵、十二烷基硫酸钠、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷等购自Ameresco公司；吐温、MgCl2·6H2O、NaCl、CaCl2等购自Sigma公司；PageRuler Prestained Protein Ladder（Thermo scientific）；ECL发光液（普利莱基因技术有限责任公司）、甲醇（国药集团）、丽春红（碧云天生物技术研究所）。

2 实验方法 2.1 脑脊液提取

家兔予茸菖胶囊灌胃3 d，每日剂量按生药为3.64 g/kg，于末次给药1 h后取脑脊液。耳缘动脉注入空气处死后，于小脑延髓池穿刺针穿刺成功后，用一次性1 mL注射器吸取600~800 μL清亮脑脊液，放入灭菌后的EP管中，于冰箱-70 ℃冻存。

2.2 原代海马神经元的培养

取新生SD大鼠海马，乙醇消毒后断头取脑，浸置于冰磷酸盐缓冲液（PBS）溶液中，钝性分离出海马，剥离脑膜后快速剪成碎块，用胰蛋白酶消化20 min，加入冰PBS溶液终止消化，加入种植培养液，以每毫升2×10⁵~3×10⁵个的浓度将神经元接种于L-多聚赖氨酸包被好的培养皿中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培养4 h，之后更换维持培养液。

2.3 海马神经元癫痫模型建立

参照Sombati等^[8]人的癫痫模型制备方法将体外培养至第9天时用无镁HBSS替代含镁正常培养基，温箱中孵育3 h，建立癫痫细胞模型。继而将HBSS溶液再次换为含镁Neurobasal培养基继续培养。该实验模型建立后需要电生理实验鉴定模型建立是否成功。

2.4 实验分组

当海马神经元培养至第9天时，将其分为下述6组并进行相应处理。正常组、模型组、3-MA组、5%茸菖胶囊组、10%茸菖胶囊组、20%茸菖胶囊组，分别将原维持液更换为含镁HBSS、无镁细胞外液、无镁细胞外液中加入3-MA（5mmol/L）、无镁外液中加入5%茸菖胶囊、10%茸菖胶囊、20%茸菖胶囊脑脊液，培养3 h后更换为Neurobasal培养液继续培养6、12、24、72 h用于实验。

2.5 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测目标蛋白表达

提取细胞总蛋白并测定蛋白浓度后，将样品蛋白进行凝胶电泳、转膜、封闭、一抗孵育（内参抗体稀释度为1:1 000）、二抗孵育（二抗稀释比例为1:10 000）等步骤，ECL法显色（暗室操作），凝胶图像分析系统测定光密度值，用ImageJ 1.43软件分析灰度值。

2.6 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件，计量数据以均数±标准差（x±s）表示，不同时间点比较采用重复测量方差分析，多组间两两比较采用LSD检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 各组大鼠海马Beclin-1蛋白表达比较

经重复测量方差分析，各组间海马Beclin-1蛋白表达水平总体均数差异有统计学意义（P < 0.05），各时间点Beclin-1蛋白表达水平总体均数差异有统计学意义（P < 0.01），时间和分组不具有交互作用（P > 0.05）。同一组内，各时点Beclin-1蛋白比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。与同一时点正常组比较，模型组Beclin-1蛋白表达无显著变化（P > 0.05）；与同一时点模型组比较，6 h 20%茸菖胶囊组及72 h 5%茸菖胶囊组显著升高（P < 0.05）。见图 1、表 1。

3.2 各组大鼠海马Bcl-2蛋白表达比较

经重复测量方差分析，各组间海马Bcl-2蛋白表达水平总体均数差异有统计学意义（P < 0.01），各时间点Bcl-2蛋白表达水平总体均数差异有统计学意义（P < 0.01），时间和分组不具有交互作用（P > 0.05）。同一组内，各时点Bcl-2蛋白比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。与同一时点正常组比较，6 h模型组Bcl-2蛋白表达显著降低（P < 0.01）。与同一时点模型组比较，12 h 20%茸菖胶囊组，24 h 20%茸菖胶囊组，72 h 5%茸菖胶囊组、10%茸菖胶囊组、20%茸菖胶囊组Bcl-2蛋白表达均显著增强（P < 0.05或P < 0.01）。72 h茸菖胶囊高、中、低三个浓度比较，20%茸菖胶囊组Bcl-2蛋白表达较5%茸菖胶囊组和10%茸菖胶囊组显著增强（P < 0.05），5%茸菖胶囊组与10%茸菖胶囊组比较无统计学差异（P > 0.05）。见图 2、表 2。

3.3 各组大鼠海马LC3B蛋白表达比较

与同一时点正常组比较，12 h模型组海马神经元LC3B蛋白表达显著增强（P < 0.05）。与同一时点模型组比较，12 h 20%茸菖胶囊组LC3B蛋白表达显著下降（P < 0.05）。见表 3。

4 讨论

近年来自噬在癫痫发生、发展过程中的重要作用逐渐受到认识。癫痫发作会引起氧化应激、离子通道异常、谷氨酸神经兴奋毒性、三磷腺苷耗竭、肿瘤坏死因子-α升高等，在这些情况下都会导致神经元自噬的发生。自噬被过度激活，可致神经元死亡，加重海马损伤及癫痫发作，并造成学习记忆及情感障碍^[9-10]。在自噬启动阶段，Beclin-1是自噬的调控基因，发挥自噬正调节作用。而Bcl-2则能够抑制自噬的发生^[11]。Beclin-1与Bcl-2作用而调控自噬与凋亡之间的平衡，自癫痫发作12~8 h Beclin-1蛋白水平开始升高，而Bcl-2蛋白水平自癫痫发作24~48 h逐渐下降^[12]。研究表明，自噬抑制剂能够通过调节自噬相关蛋白Beclin-1、Bcl-2的表达，调控癫痫或惊厥大鼠海马自噬活性，从而减少海马神经元的损伤，起到抗癫痫及神经保护作用^{[3, 13-14]}。

传统中医认为，癫痫的病机关键为风痰闭阻，多采用熄风豁痰开窍法治疗。马融教授认为，癫痫发作对于发育期的儿童而言，造成的神经损害更明显，且长期反复的癫痫发作常导致认知障碍的发生，因此治疗小儿癫痫应抗痫与益智并举。根据小儿“肾常虚”的生理特点及肾与脑的密切关系，提出小儿癫痫伴认知障碍的病机关键在于“肾精亏虚、风痰闭阻”。据此研制了茸菖胶囊（原名抗痫增智颗粒），重在抗痫与益智并举。课题组前期研究已证实，以“益肾填精法”为主的茸菖胶囊抗癫痫及改善认知损害疗效显著，在保护受损神经细胞方面具有明显优势，但这是否与茸菖胶囊调控受损神经元自噬活性有关尚未研究。本研究结果显示：1）茸菖胶囊可影响Beclin-1蛋白表达。高浓度茸菖胶囊脑脊液可在短时间内促进Beclin-1蛋白表达明显，低浓度茸菖胶囊脑脊液在维持Beclin-1蛋白表达作用较优。2）茸菖胶囊可促进Bcl-2蛋白表达抑制细胞自噬，其促进作用与给药浓度相关。综上所述，基于益肾填精法的茸菖胶囊可能通过影响Beclin-1表达干预自噬过程，促进Bcl-2蛋白表达抑制细胞自噬，发挥抗癫痫及保护海马神经元的作用。