2018, Vol. 35文章信息
- 贺雨馨, 曾宇馨, 祝天添, 朱南南, 孙志蓉
- HE Yuxin, ZENG Yuxin, ZHU Tiantian, ZHU Nannan, SUN Zhirong
- 金钗石斛及其提取物的红外光谱整体解析
- Integral analysis of Dendrobium nobile and its extracts by infrared spectroscopy
- 天津中医药, 2018, 35(7): 543-549
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2018, 35(7): 543-549
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2018.07.18
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文章历史
- 收稿日期: 2018-03-25
兰科植物金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）为2015年版中国药典中记载的石斛药材来源之一，具有养胃生津、滋阴清热等作用[1]。现代药理研究其具有明目、抗疲劳、抗衰老等作用[2]。金钗石斛的化学成分主要有多糖、生物碱、酚类化合物等[2]，具有良好的保健功能和营养价值，在市场上的需求也在不断增加。石斛属为兰科中最大的属之一，且石斛属中的药用石斛种类多达50多种[3]，使得在石斛市场中存在着以假充真、以次充好的情况。为保证金钗石斛药材的质量及临床用药的安全可靠，建立一种快速简便有效的鉴别方法极为重要。
傅里叶红外光谱法鉴别中药材是近年发展起来的一种中药材鉴定方法。红外光谱技术应用于中药材的鉴别和定性分析具有快速、简便、准确、用样量少、不破坏样品、不消耗化学试剂、不污染环境等优点，且能够反映药材的整体特征。有多个研究[4-7]采用红外光谱法对多种中药材进行鉴定和整体分析。随着傅里叶红外光谱法在中药材中的不断应用，有学者将其应用到金钗石斛的研究中，邓月娥等[8]和李莹等[9]对不同产地、不同种的金钗石斛进行红外光谱研究，但其只针对原药材进行了研究，并未对其不同提取物进行研究。石斛作为药食两用的药材，以其为原料配方的中药制剂和保健品年需求总量为8 000~10 000 t，且每年以10%~15%的速度递增[10]，这不仅需要有一个快捷鉴别金钗石斛药材的方法，同时还需要有针对其不同提取物进行快速鉴别的方法。本研究采用傅里叶红外光谱和二阶导数谱对金钗石斛不同提取溶剂中化学成分的整体变化规律进行分析，为金钗石斛的提取方法，有效部位的确定，金钗石斛的整体评价和快速鉴别提供一定的依据。
1 材料与方法 1.1 样品来源样品由北京中医药大学孙志蓉教授鉴定为兰科植物金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）的干燥茎（由贵州赤水信天药业公司提供）。
1.2 仪器与试剂仪器：Spectrum GX FTIR红外光谱仪（美国Perkin Elmer），DTGS检测器，光谱测量范围400~4 000 cm-1，光谱分辨率为4 cm-1，扫描次数为16次，OPD速度为0.2 cm-1/s，扫描时实时扣除水和二氯化碳（CO2）的干扰；变温附件为50-886型Portable Controller可编程控制单元（Love Control公司），控温范围是50~120 ℃，程序控制，原位等间隔采样，每隔10 ℃进行1次红外光谱扫描，升温速率为2 ℃/min；METTLER-AE240型1/100 000电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；XMTD-6000仪表恒温水浴锅（上海树立仪器仪表有限公司）；RJ-LDL-50G低速大容量多管离心机（无锡市瑞江分析仪器有限公司）；RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；ZN-02小型粉碎机（北京兴时利和科技发展有限公司）。
试剂：溴化钾（纯度为99.9%）、浓硫酸、苯酚、乙醇均为分析纯（北京化工厂）；淀粉和油类标准品由中国药品生物制品检定所提供。草酸钙标准品由清华大学化学实验室提供，购自西格玛奥德里奇贸易有限公司。
1.3 实验方法 1.3.1 药材粉末的制备金钗石斛药材进行干燥粉碎，过3号筛，将药材粉末用溴化钾粉末混合充分研磨（药材与溴化钾用量之比约为2:100）压片。对压片进行扫描，获得样品的红外谱图。
1.3.2 水提醇沉提取物的制备取本品粉末约0.3 g，精密称定，加水200 mL，加热回流2 h，放冷，转移至250 mL量瓶中，用少量水分次洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL，置15 mL离心管中，精密加入无水乙醇10 mL，摇匀，冷藏1 h，取出，离心（转速为4 000 r/min）20 min，弃去上清液（必要时过滤），沉淀加80%乙醇洗涤2次，每次8 mL，离心，弃去上清液，沉淀烘干即得。将烘干粉末进行溴化钾压片，红外光谱扫描。
1.3.3 无水乙醇提取物的制备精密称取样品2.0 g，置于三角瓶中，加100 mL无水乙醇，然后将样品超声（40 Hz，常温）10 min，超声之后进行离心（4 500 r/min，20 min），取上清液，浓缩后进行红外光谱扫描。
1.4 数据处理红外图谱采用Spectrum V6.3.5操作软件，对样品进行数据采集和图谱预处理，预处理过程包括基线校正和比对；二阶导数谱采用Spectrum v6.3操作软件，13点平滑。
2 结果与分析 2.1 金钗石斛药材粉末的红外光谱主体成分解析将金钗石斛药材粉末、油类和淀粉标品一维红外光谱进行对比，见图 1，金钗石斛主要吸收峰的振动方式和峰归属见表 1。从图中可以看到，油类标品具有3个特征峰（2 926 cm-1、2 854 cm-1、1 745 cm-1），金钗石斛中2 923 cm-1、2 855 cm-1、1 738 cm-1特征峰与油类这3个特征峰出峰位置相近，但峰形存在一定的差别。在1 200 cm-1以下，1 159 cm-1、1 106 cm-1、1 076 cm-1、1 035 cm-1，这组峰的位置与形状与淀粉标品1 155 cm-1、1 081 cm-1、1 019 cm-1位置的阶梯峰相似，同时金钗石斛红外谱图中，在950 cm-1以下，还有糖环骨架振动吸收等多个指纹特征峰。由于药材谱图与标品谱图所对应的特征峰较少，初步推测金钗石斛含有油类和淀粉类成分。
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| 图 1 金钗石斛原药材（a）油类和（b）淀粉标品（c）红外光谱谱图 Fig. 1 FT-IR spectra of Dendrobium (a), oil(b), starch(c), and nobile samples |
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二阶导数谱能够将一维红外光谱的重叠峰分开，进一步提高谱图的分辨率，使吸收峰的位置更加准确。将金钗石斛、油类标品一维谱图进行二阶求导，得到二阶导数图谱（图 2）。从图中可见，3 000~1 600 cm-1波段内，油类标品在2 960 cm-1、2 925 cm-1、2 852 cm-1、1 751 cm-1、1 738 cm-1处出现5个特征峰，而金钗石斛在2 920 cm-1、2 851 cm-1、1 737 cm-1处的吸收峰与油类中2 925 cm-1（亚甲基-CH2伸缩振动）、2 852 cm-1（亚甲基-CH2伸缩振动）、1 738 cm-1（酯羰基C=O伸缩振动）处的吸收峰在二阶导数红外光谱上位置接近，相差波数为5、1、1，并且峰形相似。
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| 图 2 金钗石斛（a）油类（b）二阶导数红外光谱谱图 Fig. 2 SD-IR spectra of Dendrobium(a) and oil(b) nobile samples |
金钗石斛与淀粉标品的二阶导数光谱图见图 3，在1 800~1 000 cm-1的波段范围内，金钗石斛中1 467 cm-1、1 334 cm-1、1 202 cm-1、1 163 cm-1、1 126 cm-1、1 108 cm-1、1 078 cm-1、1 056 cm-1吸收峰与淀粉中1 462 cm-1、1 333 cm-1、1 206 cm-1、1 155 cm-1、1 125 cm-1、1 107 cm-1、1 079 cm-1、1 054 cm-1等吸收峰位置相似。同时在二阶导数谱中，随着分辨率增高，芳香类成分的指纹特征峰位置更为明显，发现金钗石斛的二阶导数光谱有1 593 cm-1、1 559 cm-1、1 508 cm-1芳香环骨架伸缩振动的吸收峰，还有1 737 cm-1、1 635 cm-1等C=O伸缩振动吸收峰。二阶导数谱图的比对，再次明确金钗石斛中含有脂类和淀粉类成分，并含有芳香类物质。
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| 图 3 金钗石斛（a）和淀粉标品（b）二阶导数红外光谱谱图 Fig. 3 SD-IR spectra of Dendrobium(a) and starch(b) nobile samples |
金钗石斛二阶导数图谱中在1 318 cm-1附近有强吸收峰，猜测可能为草酸钙的吸收峰，为了确定石斛中是否含有草酸钙成分，进一步将金钗石斛原药材粉末与草酸钙标品的二阶导数谱图进行比对，见图 4。发现草酸钙有2个特征强峰，1 318 cm-1和782 cm-1，金钗石斛中1 318 cm-1、763 cm-1吸收峰和草酸钙中特征强峰在二阶导数红外光谱上位置一致，说明金钗石斛中都含有草酸钙成分。
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| 图 4 金钗石斛（a）和草酸钙（b）标品二阶导数红外光谱谱图 Fig. 4 SD-IR spectra of calcium Dendrobium(a) and oxalate(b) nobile samples |
采用中国药典中提取金钗石斛多糖的方法提取金钗石斛原药粉，提取物进行红外光谱扫描，对比金钗石斛水提醇沉提取物和金钗石斛原药粉的一维红外图谱，见图 5。提取物的出峰位置和原药材有明显差异，并且提取物的峰数明显少于原药材，说明化学成分种类减少，提取物和原药粉具体特征峰的出峰位置见表 2。金钗石斛水提醇沉提取物中1 741 cm-1与1 651 cm-1附近的相对峰强度有明显变化，提取后1 741 cm-1附近的峰强度接近1 651 cm-1附近的峰强度；糖区的各个特征峰强度也明显增强，说明金钗石斛水提醇沉后粗多糖含量明显增多，这也说明金钗石斛多糖多为水溶性糖；并且出现了1 080 cm-1附近特征峰，说明金钗石斛多糖多以糖苷的形式存在。
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| 图 5 金钗石斛水提醇沉提取物（a）和金钗石斛原药粉（b）红外光谱图 Fig. 5 FT-IR spectra of the water extraction and alcohol precipitation extract samples(a) and Dendrobium nobile samples(b) |
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金钗石斛水提醇沉提取物和原药材粉末二阶导数谱图，见图 6，可见特征峰的差异更加明显，具体的出峰位置见表 3。金钗石斛水提醇沉提取物在1 800~1 000 cm-1波段范围内，共有2个强峰，1 158 cm-1和1 079 cm-1，其中1 079 cm-1是最强峰，中强峰2个分别为1 747 cm-1和1 020 cm-1，弱峰若干；金钗石斛原药粉有2个强峰，1 467 cm-1和1 163 cm-1，其中1 163 cm-1为最强峰，中强峰8个分别为1 737 cm-1、1 593 cm-1、1 508 cm-1、1 421 cm-1、1 376 cm-1、1 126 cm-1、1 078 cm-1和1 056 cm-1，弱峰若干，并且在该波段内峰形、峰位置、峰强度都有显著差异。1 600~1 300 cm-1波段内，提取物出峰数量明显减少且峰强较原药材小，说明提取物中芳香类成分含量减少。
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| 图 6 金钗石斛水提醇沉提取物（a）和金钗石斛原药粉（b）二阶导数红外光谱图 Fig. 6 SD-IR spectra of the water extraction and alcohol precipitation extract samples(a) and Dendrobium nobile samples(b) |
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金钗石斛水提醇沉提取物与淀粉标品的一维红外光谱谱图见图 7。金钗石斛提取物峰1 156 cm-1，1 080 cm-1，1 022 cm-1与淀粉标准谱图参考峰1 155 cm-1、1 081 cm-1、1 019 cm-1相似，两者的相差波数为1、1、3，且金钗石斛提取物红外光谱形状与淀粉标品谱图相似，因此可以推断金钗石斛多糖多为淀粉成分。具体出峰情况见表 4。并且把金钗石斛水提醇沉提取物和淀粉标品进行相关系数分析，取糖区1 200~1 000 cm-1波段，把金钗石斛水提醇沉提取物和淀粉标品谱图进行相关系数分析，金钗石斛与淀粉标品的相关系数为0.945。
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| 图 7 金钗石斛水提醇沉提取物（a）和淀粉标品（b）红外光谱图 Fig. 7 FT-IR spectra of starch(b) and the water extraction and alcohol precipitation extract samples(a) |
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由金钗石斛水提醇沉提取物及淀粉标品红外光谱二阶导数可见，金钗石斛与淀粉标品重叠峰更多，且峰形也更为接近，尤其在1 000~1 200 cm-1波段内，金钗石斛峰1 158 cm-1、1 104 cm-1、1 079 cm-1、1 056 cm-1、1 020 cm-1与淀粉峰1 155 cm-1、1 125 cm-1，1 107 cm-1、1 079 cm-1、1 054 cm-1，1 019 cm-1位置非常相似，再一次证明金钗石斛水提醇沉提取物多为淀粉成分，见图 8。具体的出峰位置见表 5。通过以上分析可知金钗石斛水提醇沉提取物大部分是淀粉成分。
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| 图 8 金钗石斛水提醇沉提取物（a）和淀粉（b）标品的二阶导数红外光谱图 Fig. 8 SD-IR spectra of starch (b)and the water extraction and alcohol precipitation extract samples(a) |
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将金钗石斛无水乙醇提取物进行红外光谱扫描，并将无水乙醇提取物、水提醇沉提取物以及原药材粉末的一维红外图谱进行比对，见图 9。无水乙醇提取物在2 925 cm-1、2 853 cm-1位置峰强明显高于原药材在2 923 cm-1、2 855 cm-1处的峰强，可以认为无水乙醇提取物中脂肪类成分含量高于原药材。而无水乙醇提取物在1 200~1 000 cm-1糖区段内出峰数量明显少于水提醇沉提取物，说明无水乙醇提取物中多糖含量较少。具体的特征峰出峰位置见表 6。
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| 图 9 金钗无水乙醇提取物（a）、水提醇沉提取物（b）和原药材（c）红外光谱图 Fig. 9 FT-IR spectra of the anhydrous ethanol extract samples (a) the water extraction and alcohol precipitation extract samples(b) and Dendrobium nobile samples(c) |
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将金钗石斛无水乙醇提取物与油类标准品一维红外谱图进行比对，见图 10，具体出峰位置见表 7。金钗石斛无水乙醇提取物在2 925 cm-1、2 853 cm-1、1 735 cm-1、1 462 cm-1位置处出峰。石斛药材无水乙醇提取物中的特征峰与脂肪类成分参考峰越接近，且能对应的峰个数越多，则该药材中脂类含量越高，因此，金钗石斛无水乙醇提取物中脂类成分含量相对大。
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| 图 10 金钗石斛无水乙醇提取物（a）和油类（b）红外光谱图 Fig. 10 FT-IR spectra of oil(a) and the anhydrous ethanol extract samples(b) |
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从金钗石斛原药材和不同提取物的一维红外光谱分析可知，原药材和提取物含有相似的特征峰，如2 920 cm-1（亚甲基-CH2伸缩振动）、1 737 cm-1（酯羰基C=O伸缩振动）附近的特征峰、1 000~1 200 cm-1（C-O伸缩振动）波段内的特征峰，可以初步判定金钗石斛中有多糖、脂类、芳香类化合物，并且通过与标准品的比对确定有淀粉类和油类物质。一维红外图谱在一定程度上存在着重叠峰，致使一些特征峰被隐藏，而二阶导数谱可以使隐藏峰显露，对于整体结构解析更为完整。通过二阶导数谱进一步佐证了以上的实验结果，同时在原药材的二阶导数谱中，可以观察到1 318 cm-1和763 cm-1的吸收峰，该吸收峰分别为草酸根负离子中C-O键的对称伸缩振动和弯曲振动，表明金钗石斛具有草酸钙的特征峰，而草酸钙是植物生长发育过程中次级代谢产物，广泛分布于植物细胞中，这样的变化说明二阶导数谱相较于一维谱图更全面。不同提取方式所提取的物质含量存在极大的差别，通过特征峰峰强可以简单快捷地判断某种物质的含量。水提醇沉提取物红外谱图证明了金钗石斛中含有大量的水溶性多糖，且主要以淀粉形式存在。而无水乙醇提取物的谱图则证明了金钗石斛中脂类相对含量较大，完美体现了“相似相溶”的原则。
金钗石斛现不仅作为药典记载的石斛药材来源之一，同时也是药食同源的药材，更是保健品市场研究的热点，故市场中金钗石斛掺假的现象屡见不鲜，目前市场中把兰科金石斛属、石仙桃属和石豆兰属数十种植物也作为中药石斛混入商品流通及药用石斛混种混收等现象依然存在。出现这些问题的主要原因在于药用石斛鉴定方法不够完善，鉴定指标不够明确。本实验采用红外光谱法结合二阶导数分析技术获得金钗石斛的整体结构信息，为今后系统完整的石斛鉴定研究打下了基础，也为基原相近、易混淆的中药鉴别提供了一个可发展的方向，同时为中药材不同提取物的鉴别提供了思路。
红外光谱与二阶导数谱图的结合，能够对金钗石斛进行整体分析，并且通过对不同提取谱图的研究，能观察到金钗石斛中化学成分的整体变化，有助于对药材进行整体的质量控制和鉴别，并且本实验在对原药材进行研究同时，增加了对不同提取物的研究，使得整体分析更为全面。本研究结果证明红外光谱整体结构解析与鉴定方法用于石斛这类价格昂贵、资源获得困难的中药材非常适合，其应用对于实现石斛药材快速鉴别及质量评价与控制具有非常重要的意义。
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